Summary
Desenvolvemos um método para detectar zoospores Phytophthora capsici em fontes de água usando um método de extração de DNA de papel filtro juntamente com um ensaio de amplificação isotérmica mediada em loop (LAMP) que pode ser analisado no campo ou no laboratório.
Abstract
Phytophthora capsici é um patógeno oomycete devastador que afeta muitas culturas solanáceas e cucurbits importantes, causando perdas econômicas significativas na produção de vegetais anualmente. Phytophthora capsici é transmitida pelo solo e um problema persistente nos campos vegetais devido às suas estruturas de sobrevivência de longa duração (oosporos e clamídias) que resistem ao intemperamento e degradação. O principal método de dispersão é através da produção de zoosporos, que são esporos sinalizados de célula única que podem nadar através de filmes finos de água presentes em superfícies ou em poros de solo cheios de água e podem se acumular em poças e lagoas. Portanto, as lagoas de irrigação podem ser uma fonte do patógeno e dos pontos iniciais de surtos da doença. A detecção de P. capsici na água de irrigação é difícil usando métodos tradicionais baseados em cultura porque outros microrganismos presentes no ambiente, como pythium spp., geralmente superreceu P. capsici tornando-o indetectável. Para determinar a presença de esporos de P. capsici em fontes de água (água de irrigação, escoamento, etc.), desenvolvemos um método de filtro à base de bomba manual (8-10 μm) que captura os esporos do patógeno (zoospores) e é posteriormente usado para amplificar o DNA do patógeno através de um novo ensaio de amplificação isotérmica mediada por loop (LAMP) projetado para a amplificação específica de P. Este método pode amplificar e detectar DNA a partir de uma concentração tão baixa quanto 1,2 x 102 zoospores/mL, que é 40 vezes mais sensível do que o PCR convencional. Não foi obtida amplificação cruzada ao testar espécies intimamente relacionadas. A LÂMPADA também foi realizada utilizando um corante de mistura mestre lampimétrica, exibindo resultados que poderiam ser lidos a olho nu para detecção rápida no local. Este protocolo pode ser adaptado a outros patógenos que residem, acumulam ou são dispersos através de sistemas de irrigação contaminados.
Introduction
A reciclagem de água em fazendas e viveiros está se tornando cada vez mais popular devido ao aumento dos custos de água e preocupações ambientais por trás do uso da água. Muitos métodos de irrigação foram desenvolvidos para os produtores reduzirem a propagação e a ocorrência de doenças vegetais. Independentemente da fonte da água (irrigação ou precipitação), o escoamento é gerado, e muitos produtores de hortaliças e berçários têm uma lagoa para coletar e reciclar o escoamento1. Isso cria um reservatório para possível acúmulo de patógenos favorecendo a disseminação de patógenos quando a água reciclada é usada para irrigar as culturas2,,3,4. Os patógenos vegetais oomycete se beneficiam particularmente dessa prática, pois os zoosporos se acumularão na água e o esporo dispersivo primário é auto-motil, mas requer água superficial5,,6,,7. Phytophthora capsici é um patógeno oomycete que afeta um número significativo de culturas solanáceas e cucurbitas de diferentes maneiras8. Muitas vezes, os sintomas são amortecimento de mudas, raízes e podridão da coroa; no entanto, em culturas como pepino, abóbora, melão, abóbora, melancia, berinjela e pimenta, colheitas inteiras podem ser perdidas devido à podridão de frutas9. Embora existam métodos conhecidos de detecção desse patógeno vegetal, a maioria requer uma infecção que já tenha ocorrido, o que é tarde demais para que quaisquer fungicidas preventivos tenham um efeito significativo10.
O método tradicional de teste da água de irrigação para a detecção e diagnóstico de microrganismos direcionados é uma abordagem antiquada quando a velocidade e a sensibilidade são cruciais para o sucesso e a produção rentável da cultura11,12. O tecido vegetal suscetível ao patógeno-alvo (por exemplo, berinjela para P. capsici) é anexado a uma armadilha modificada que é suspensa em uma lagoa de irrigação por um período prolongado antes de ser removida e inspecionada para infecção. As amostras do tecido vegetal são então banhadas em mídia semi-seletiva (PARPH) e incubadas para o crescimento da cultura, em seguida, a identificação morfológica é realizada usando um microscópio composto13. Existem outros métodos de detecção semelhantes para outros patógenos vegetais usando mídia seletiva e emplacando pequenas quantidades de água contaminada antes de sub-cultivo14,15. Esses métodos requerem entre 2 e 6 semanas, várias rodadas de subcultura para isolar o organismo, e experimentam em diagnósticos de Phytophthora para serem capazes de reconhecer os principais caracteres morfológicos de cada espécie. Esses métodos tradicionais não funcionam bem para detecção de água de irrigação contaminada por P. capsici devido a fatores como a interferência de outros microrganismos que também estão presentes nas fontes de água. Alguns microrganismos de rápido crescimento, como pythium spp. e bactérias transmitidas pela água podem crescer demais na placa tornando P. capsici indetectável16,17.
O objetivo deste estudo foi desenvolver um método molecular sensível e específico que possa ser utilizado tanto em ambientes de campo quanto em laboratório para detectar zoospores P. capsici na água de irrigação. O protocolo inclui o desenvolvimento de um novo primer de amplificação isotérmica mediada em loop (LAMP) capaz de amplificar especificamente P. capsici, baseado em um fragmento de par de 1121 bases (bp) de P. capsici18,19. Um primer LAMP previamente desenvolvido de Dong et al. (2015) foi utilizado em comparação com o ensaio que foi desenvolvido para este estudo20.
O ensaio LAMP é uma forma relativamente nova de detecção molecular que tem sido demonstrada ser mais rápida, sensível e específica do que a reação convencional de cadeia de polimerase (PCR)21. Em geral, os ensaios convencionais de PCR não podem detectar menos de 500 cópias (1,25 pg/μL); em contraste, estudos anteriores mostraram que a sensibilidade da LÂMPADA pode ser 10 a 1.000 vezes maior que a pcr convencional e pode facilmente detectar até mesmo 1 fg/μL de DNA genômico22,23. Além disso, o ensaio pode ser realizado rapidamente (muitas vezes em 30 minutos) e no local (no campo) usando um bloco de aquecimento portátil para amplificação e um corante colorimétrico que muda de cor para uma amostra positiva (removendo a necessidade de eletroforese). Neste estudo, comparamos a sensibilidade dos ensaios PCR e LAMP utilizando um método de extração de filtro. O método de detecção proposto permite que pesquisadores e agentes de extensão detectem facilmente a presença de esporos de P. capsici de diferentes fontes de água em menos de duas horas. O ensaio é provado ser mais sensível do que o PCR convencional e foi validado in situ detectando a presença do patógeno na água de irrigação usada por um produtor. Este método de detecção permitirá que os produtores estimem a presença e a densidade populacional do patógeno em várias fontes de água que estão sendo utilizadas para irrigação, prevenindo surtos devastadores e perdas econômicas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Detecção no local de Phytophthora capsici da água de irrigação usando amplificação isotérmica mediada por loop portátil
- Configuração da bomba e do filtro
- Conecte um frasco de filtragem a um tubo conectado a uma bomba de mão para que, quando a bomba for ativada, o ar seja puxado pela boca do frasco filtrante.
- Coloque o funil Buchner na rolha de borracha na boca do frasco filtrante e coloque o pedaço de papel filtro de tamanho apropriado no funil Buchner para que o ar seja puxado através do papel filtro. O papel filtro deve ter um tamanho de retenção de 15 μm.
NOTA: O papel filtro deve caber nas bordas do funil Buchner para que a água mínima flua ao redor do papel do filtro.
- Amostragem e filtragem de água
- Pegue amostras de água da fonte alvo. A água pode ter pequenas quantidades de detritos, mas não sedimentos ou solo significativos.
- Despeje até 1.000 mL (1 Litro) de água de teste sobre o papel filtro colocado dentro do funil Buchner lentamente o suficiente para evitar o transbordamento, enquanto a bomba de mão (ou vácuo) está sendo usada para criar uma sucção para puxar a água.
NOTA: Não há quantidade mínima de água que possa ser testada usando este método, e embora seja sugerido pelo menos 50 mL, 1000 mL é o máximo para este método. - Usando fórceps, remova o papel filtro do funil Buchner e corte-o em pequenos pedaços com uma tesoura estéril. Adicione o máximo de peças (8-12) que podem ser submersas na quantidade de tampão de extração (400 μL para extração magnética à base de contas) exigida pelo protocolo em um tubo de 1,5 mL. Guarde pedaços restantes de papel filtro para processamento após a extração do primeiro conjunto.
- Vórtice ou agitar os pedaços de papel filtro e tampão de extração por 10 s a cada minuto por 5 minutos. Em seguida, usando fórceps, remova o papel filtro perdendo o mínimo possível do tampão de extração. Repita esta etapa com as peças restantes de papel filtro até que todas as peças tenham sido vórtices/agitadas e encharcadas no tampão de extração.
- Extração magnética baseada em contas de DNA a partir de papel filtro
- Ao tubo de 1,5 mL (que agora contém aproximadamente 200-300 μL de tampão de extração), adicione 20 μL de proteinase K e 10 μL de 10 ng/μL RNase.
- Incubar em temperatura ambiente por 15 minutos, vórtice ou agitar o tubo a cada 3 minutos.
- Adicione 500 μL de contas magnéticas com o tampão de ligação à amostra e misture bem tremendo. Em seguida, incubar por 5 minutos em temperatura ambiente.
- Coloque o tubo no rack separador magnético por 2 minutos até que todas as contas tenham sido puxadas para o ímã. Remova e descarte o supernaspe.
- Remova o tubo do separador magnético. Adicione 500 μL de Wash Buffer 1 e suspenda as contas agitando vigorosamente o tubo. Espere por 30 s e, em seguida, coloque o tubo de volta no separador magnético. Aguarde 2 minutos até que todas as contas tenham sido puxadas para o ímã antes de remover e descartar o supernante.
NOTA: Ao esperar que as contas magnéticas magnetizem para o separador, recomendamos inverter o tubo, que pode desalojar contas magnéticas presas à tampa e às laterais do tubo e resultar em um maior número de contas sendo anexadas. - Repita o passo 1.3.5 com 500 μL de Wash Buffer 2.
- Repetição passo 1.3.5 com 500 μL de 80% de etanol.
- Doer a pelota magnética por 15 minutos à temperatura ambiente (18-27 °C) com a tampa aberta. Se as temperaturas não permitirem, incubar em uma mão enluvada com a tampa aberta por 15 minutos.
- Remova o tubo do separador magnético. Adicione 50 μL de tampão de elução e suspenda as contas por tubulação para cima e para baixo por 1 min.
- Coloque o tubo de volta em um separador magnético. Espere 2 minutos antes de transferir o supernatante sem perturbar as contas para um tubo separado para armazenamento de DNA.
NOTA: Aqui o experimento pode ser pausado antes de seguir em frente. O DNA extraído deve ser armazenado no gelo ou em um congelador de -20 °C.
- Aplicação do ensaio LÂMPADA recém-desenvolvido
- Prepare o primer LAMP usando 0,2 μM de cada primer F3 e B3, 0,8 μM de cada primer Loop-F e Loop-B e 1,6 μM de cada primer FIP e BIP(Tabela 2).
- Adicione a seguinte solução LAMP a um único tubo PCR, ou a cada tubo individual na tira de tubo de 8: 2,5 μL de mix de primer (passo 1.4.1), 12,5 μL de mistura mestre lava lâmpada, 1 μL de DNA extraído e 9 μL de ddH2O. O volume total é de 25 μL.
NOTA: Se utilizar o instrumento de amplificação portátil (por exemplo, Genie III) com corante colorimétrico (por exemplo, Warmstart), consulte a seção 2.4.2- 2.4.3. - Designe dois tubos como controles positivos e negativos. Para o controle positivo, use um controle fornecido pelo kit LAVA LAMP, ou uma amostra de DNA positiva conhecida. Para o controle negativo, use ddH2O. Para ambos, substitua o 1 μL de DNA extraído por 1 μL do controle positivo ou ddH2O.
- Coloque as amostras em um bloco de calor (ou instrumento de amplificação portátil) definido para 64 °C por 45 min.
NOTA: Outros métodos de extração podem ser usados aqui em vez de extração baseada em contas magnéticas. CTAB e um kit comercial de extração de DNA foram testados com sucesso usando os protocolos padrão e substituindo os pedaços de papel filtro para a amostra da planta24,25. Os resultados foram comparados na Tabela 2. Se a concentração de DNA pode ser quantificada, use entre 1-10 ng DNA genômico.
- Visualização de resultados
- Se realizado em um ambiente de laboratório, visualize os produtos de amplificação carregando 5 μL de cada amostra em um gel de 1% de agarose, executando-os em uma máquina de eletroforese de gel e exibindo-os em uma máquina de imagem UV.
- Se for utilizado um corante colorimétrico (por exemplo, Warmstart), veja a mudança de cor para determinar os resultados como positivos ou negativos.
- Se um instrumento de amplificação portátil (por exemplo, Genie III) foi usado, visualize o gráfico de amplificação na tela para determinar os resultados.
- Aplicação de ensaio PCR previamente desenvolvido
NOTA: Se usar um ensaio PCR convencional, as etapas 1-3 permanecem as mesmas, e as seguintes etapas devem ser aplicadas no lugar das etapas 1.4 e 1.5.- Adicione 1 μL de cada extração de DNA a tubos individuais contendo os seguintes componentes: 12,5 μL de mix mestre PCR verde, 9,5 μL de ddH2O e 1 μL de primers dianteiros e invertidos(Tabela 2).
- Gire cada amostra usando um microcentrifuuge e coloque tubos em um cicloviário térmico.
- Use as seguintes configurações de cicloviário térmico de acordo com as publicações anteriores: 94 °C para 5 min, 30 ciclos de desnaturação a 94 °C para 30 s, ressarnamento a 54 °C para 30 s, extensão a 72 °C por 1 min, e extensão final a 72 °C para 10 min.
- Execute o produto em um gel de 1% de agarose. Observe a presença de bandas sob luz UV onde reações positivas terão um tamanho de banda de ~508 bp.
- Método tradicional de detecção
NOTA: Existem vários métodos de revestimento seletivo para detecção de patógenos, e o seguinte é um protocolo geral para P. capsici.- Primeiro, obtenha uma fruta de berinjela saudável (um hospedeiro suscetível para P. capsici) e esterilizar a superfície da fruta com 70% de álcool isopropílico.
- Coloque a fruta de berinjela em caixas de leite com um dispositivo de flutuação (espuma de polietileno ou outra) e implante em lagoas de irrigação. Fixar cada armadilha de isca em um único ponto e deixar as armadilhas no reservatório de água (água de irrigação reciclada) por pelo menos 7 dias ou até que os sintomas da podridão das frutas sejam observados. Pegue a fruta e transporte para o laboratório.
- Enxágüe e seque a fruta em uma coifa estéril antes de remover pequenos pedaços de tecidos infectados e coloque-os em uma placa de meio PARPH emendada com 25 mg/L pentachloronitrobenzene, 0,0005% pimaricina, 250 mg/L ampicillin, 10 mg/L rifampicina e 50 mg/L de hímolazol. Incubar placas a 25 °C durante 5 dias.
- Veja as placas sob um microscópio composto para identificação morfológica tradicional em 4 dias após o isolamento.
2. Determinando o limite de detecção da concentração de zoosporos
- Tornando a suspensão do zoospore
- Incubar P. capsici no ágar V8 (100 mL de suco V8, 900 mL de ddH2O, 1 g de CaCO3) pratos por 1 semana a 26 °C. Várias placas podem ser usadas para obter uma maior quantidade de suspensão zoospora.
- Incubar as placas sob luz contínua à temperatura ambiente por 3 dias para estimular a esporulação.
- Dilua as placas adicionando 15 mL de ddH2O a cada prato e coloque-as em uma geladeira de 4 °C por 25 min. Em seguida, volte à temperatura ambiente por 30 minutos.
- Agitar placas para desalojar zoospores e pipetar a solução em um único tubo de 50 mL de todas as placas.
- Para obter uma estimativa precisa da concentração de zoospore, adicione 10 μL da suspensão do esporo em um hemótmetro e observe sob um microscópio para contar zoosporos e estimar a concentração média.
- Diluição serial
- Adicione 1 mL da suspensão do esporo e 9 mL de ddH2O a um tubo separado. Repita esta etapa para quantas diluições de 10 vezes desejarem.
- As soluções de esporos são então submetidas à extração de DNA com base no protocolo anterior usando o método de filtragem.
NOTA: Se for desejado um volume maior de suspensão, dobre o volume: 2 mL de suspensão de esporos e 18 mL de ddH2O.
- Detecção do limite de concentração de zoospore
- Avalie o limite de detecção de esporos executando cada diluição serial individualmente através do ensaio até que resultados claramente positivos não sejam mais observados. Uma vez obtida a diluição final, dilui por um fator de 2 (4,8 a 2,4 neste exemplo) e execute o ensaio novamente para obter um limite de detecção mais preciso.
- Desenvolvimento e otimização do método LAMP
NOTA: Os primers lamp foram projetados com base em um fragmento de par de 1121 bases (bp) de P. capsici (Li et al.19) conforme mostrado na Figura Suplementar 2.- Se for utilizado corante colorimétrico (por exemplo, Warmstart), utilize a seguinte solução: 2,5 μL de mix de primer, 12,5 μL de corante colorimétrico, 0,5 μL de corante fluorescente verde, 1 μL de DNA extraído e 8,5 μL de ddH2O. O volume total é de 25 μL.
- Ao utilizar o instrumento de amplificação portátil com mastermix LAVALAMP, tenha uma etapa inicial de 95 °C para 3 min conforme recomendado pelo fabricante, mas isso não é necessário. Uma etapa final de ressaramento não é necessária para observar a mudança de cor ou o gráfico de amplificação. Não execute uma etapa de partida quente se o corante colorimétrico comercial for usado.
- Ver o ensaio LAMP resulta em um dos seguintes métodos: executar amostras em um gel de 1% de agarose ou ver usando uma máquina de imagem UV a olho nu ou vista na tela de amplificação em tempo real do Genie III.
- Otimize a temperatura do ensaio LAMP usando o instrumento de amplificação portátil e analise usando o gráfico de amplificação em tempo real para velocidade e nível de sensibilidade. Execute amostras com temperaturas únicas para determinar a amplificação mais rápida com o maior nível de sensibilidade.
- Determine o limite de detecção da LÂMPADA desenvolvida por meio da diluição serial do DNA extraído (como com a suspensão do esporo na etapa 2.2.1) e mantendo condições de reação como descrito anteriormente para a reação LAMP para cada diluição.
- Determinação e comparação do limite de detecção com o método PCR convencional
- Use DNA extraído em etapas na seção 1.3 para comparar o nível de detecção do PCR convencional com o do ensaio LAMP.
- Adicione 1 μL de DNA a um tubo PCR que continha 1 μL de primers PCR dianteiros e invertidos(Tabela 2),12,5 μL de Green PCR Mastermix e 9,5 μL de ddH2O para um total de 25 μL.
- Amplie as amostras em um cicloviário térmico utilizando as seguintes condições: 94 °C para 5 min, 30 ciclos de desinaturação a 94 °C para 30 s, ressarem a 54 °C para 30 s, extensão a 72 °C por 1 min e extensão final a 72 °C por 10 min.
- Execute amostras em uma máquina de eletroforese em um gel de 1% de agarose e veja em uma máquina de imagem UV. O tamanho da banda com exceção foi de 508 bp.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Otimização do método LAMP
Neste estudo, detectamos a presença de Phytophthora capsici na água de irrigação usando um ensaio portátil de amplificação isotérmica mediada por loop (LAMP). Primeiro, o ensaio lampião proposto foi otimizado testando diferentes concentrações de primer lamp [F3, B3 (0,1-0,5 μM cada); LF, LB (0,5-1,0 μM cada) e FIP, BIP (0,8-2,4 μM cada)], durações (30-70 min) e temperaturas (55-70 °C). O mix final de primer LAMP utilizado neste estudo foi: 0,2 μM de cada primer F3 e B3, 0,8 μM de cada primer Loop-F e Loop-B, 1,6 μM de cada primer FIP e BIP. A otimização da temperatura de reação foi realizada no instrumento de amplificação portátil (por exemplo, Genie III) determinando qual temperatura realizou a reação mais rápida sem amplificação negativa adicional. A temperatura ideal foi confirmada como 64 °C (dados não apresentados). O tempo ideal para a execução do ensaio a 64 °C foi de 45 min, pois as concentrações mais baixas positivas para detecção (1,2 x 102 esporos/mL) ainda amplificadas em 40 minutos, enquanto as concentrações mais elevadas amplificadas em 20 min(Figura 2D). Os produtos LAMP amplificados foram ainda observados em gel de 1% de agarose manchado com uma mancha de ácido nucleico para confirmar a amplificação. Todas as reações foram repetidas pelo menos três vezes.
Isolados de P. capsici foram retirados do Tennessee, Flórida e Geórgia e submetidos ao mesmo protocolo descrito nos métodos. Todas as amostras de isolados de P. capsici foram amplificadas com sucesso em todas as corridas do ensaio (Figura 3).
Teste de detecção e sensibilidade de Phytophthora capsici em água de irrigação usando ensaio de LÂMPADA portátil
Padronizamos este método LAMP baseado em papel filtro em condições laboratoriais usando uma diluição serial das suspensões de esporos de P. capsici (Figura 1). Diluições seriais foram feitas a partir de uma suspensão de esporos P. capsici a partir de 4,8 x 104 zoospores/mL e executado com o ensaio LAMP em triplicado. Concentrações de esporos são mostradas em vez de concentração de DNA devido ao método envolvido para extração de DNA. A extração de DNA CTAB da maior concentração de esporos foi de 4,5 ng/μL medido por Nanodrop, e o protocolo de extração de DNA de contas magnéticas rendeu 3,8 ng/μL26. O conjunto de primer LAMP recém-projetado poderia detectar uma concentração tão baixa quanto 1,2 x 102 esporos/mL(Figura 2B, 2C, & 2D) com todos os métodos de extração. A sensibilidade mostrada no gráfico de amplificação no instrumento de amplificação portátil era idêntica à mostrada na imagem UV sem sensibilidade adicional. A mesma diluição serial foi executada em uma reação LAMP usando o corante colorimétrico para determinar o nível de sensibilidade a olho nu para detecção de campo. A menor concentração observável foi de 4,8 x 103 esporos/mL (Figura 2C).
Para avaliar a capacidade deste ensaio utilizando amostras do mundo real, foram coletadas amostras de água de sete lagoas utilizadas para produção comercial de hortaliças no Condado de Tift, Geórgia (Tabela 1, Figura 5e Figura Suplementar 1). Das 7 lagoas, 3 apresentaram resultados positivos de LÂMPADA (P1, P4 e P6) (Figura 6A, 6B, & 6C). Esses resultados sugerem que o método LAMP baseado em papel de filtro portátil pode ser muito útil para a detecção do patógeno mesmo com uma baixa concentração de zoospore. Isso demonstra a aplicabilidade do LAMP como um ensaio de detecção mais sensível do que o PCR para a triagem da contaminação da água de irrigação por P. capsici.
Análise comparativa de diferentes métodos: Isca tradicional, PCR convencional e o ensaio portátil baseado em LÂMPADA
Para comparar a sensibilidade de detecção da LÂMPADA com o PCR convencional, o DNA extraído da diluição serial das suspensões de esporos foi executado em uma reação pcr. Os resultados mostraram que o PCR convencional era 40x menos sensível que o LAMP, apenas capaz de detectar uma concentração de zoospore tão baixa quanto 4,8 x 103 esporos/mL(Figura 2A). Além disso, as amostras de DNA obtidas a partir da água filtrada da lagoa de irrigação foram testadas utilizando PCR convencional, e apenas uma das três amostras positivas (P4) foi amplificada com sucesso como tamanho de banda esperado mais contaminações significativas resultando em algumas bandas de difamação e inespecíficas(Figura 6D). A Tabela 3 exibe as diferenças entre os métodos de detecção usando variáveis como tempo, custo, sensibilidade e preparação necessárias. A LÂMPADA foi o método mais barato entre esses três métodos e também foi o mais rápido, variando de 30 a 60 min para amplificação (extração de DNA excluída). O PCR convencional variou de 120 a 180 min para amplificação (extração de DNA excluída).
Finalmente, para determinar a especificidade dos primers, amostras de patógenos oomyceto intimamente relacionados(Phytophthora sansomeana, Phytophthora sojae, Phytophthora cinnamomi, Phytophthora palmivora, Pythium ultimum var. ultimum, Phytopythium vexans, Phytopythium helicoides, e Pythium aphanidermatum) foram obtidos, o DNA foi extraído utilizando o mesmo protocolo de consistência e avaliado pelo novo ensaio LAMP com um controle positivo e negativo (Figura 4) para determinar a especificidade dos primers. Todas as amostras não-alvo foram negativas utilizando-se os 64 °C otimizados para 45 min. Isso foi observado no gráfico de amplificação em tempo real e retratado em um gel de 1% de agarose sob luz UV.
Figura 1: Diagrama mostrando os diferentes passos envolvidos em Phytophthora capsici a partir de uma diluição serial de uma suspensão concentrada de esporos em condições laboratoriais. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Otimização laboratorial do limite para detecção de Phytophthora capsici. (A) O ensaio convencional de PCR foi realizado utilizando primers P. capsici específicos em fatores de diluição serial e visualizados em gel de 1% de agarose. 1, Escada; 2-7, 4.8 x 104, 4.8 x 103, 4.8 x 102, 2.4 x 102, 1.2 x 102 esporos/mL, respectivamente e 7, controle de água negativo. (B) Os fatores de diluição seriais do ensaio de lâmpada visualizados em gel de 1% de agarose. 1-6, uma concentração de esporos decrescente: 4,8 x 104, 4,8 x 103, 4,8 x 102, 2,4 x 102, 1,2 x 102 esporos/mL, e 7, controle negativo de água. (C) Resultados de LÂMPADA visualizados utilizando o corante colorimétrico. 1-6, uma concentração de esporos decrescente: 4,8 x 104, 4,8 x 103, 4,8 x 102, 2,4 x 102, 1,2 x 102 esporos/mL, e 7, controle negativo de água. (D) Resultados de LÂMPADA visualizados no gráfico de amplificação. Vermelho = 4,8 x 104, Azul escuro = 4,8 x 103, Laranja = 4,8 x 102, Azul claro = 2,4 x 102, Verde = 1,2 x 102 esporos/mL, Rosa = Controle negativo (outras espécies Phytophthora), Amarelo = ddH2O. (E) Uma curva padrão mostrando quantificação dos valores mostrados nos resultados em tempo real. Em (contagem de esporos) é mostrado no eixo X, e minutos para amplificação no eixo Y. (F) ensaio LAMP com primer publicado (Dong et al. 2015) sobre fatores de diluição serial visualizados em gel de 1% de agarose. 1-6, uma concentração de esporos decrescente: 4,8 x 104, 4,8 x 103, 4,8 x 102, 2,4 x 102, 1,2 x 102 esporos/mL, e 7, controle negativo de água. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Amplificação do DNA de P. capsici de vários locais. (A) Resultados de LÂMPADA visualizados em gel de 1% de agarose. 1, PC_TN1; 2, PC_TN2; 3, PC_FL1; 4,PC_FL2; 5, PC_GA1; 6, PC_GA2; N, controle negativo. As amostras 1 e 2 foram isoladas da TN; amostras 3 e 4 isoladas da FL; amostras 5 e 6 foram isoladas de GA. (B) Resultados visualizados utilizando o corante colorimétrico. 1, PC_TN1; 2, PCTN2; 3, PC_FL1; 4,PC_FL2; 5, PC_GA1; 6, PC_GA2. (C) Resultados visualizados no gráfico de amplificação. Vermelho, PC_TN1; Laranja, PCTN2; Amarelo, PC_FL1; Verde, PC_FL2; Azul escuro, PC_GA1; Azul claro, PC_GA2; Rosa, controle negativo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Determinação de especificidade do ensaio da LÂMPADA utilizando DNA de espécies não-alvo P. capsici. (A) Reação de ensaio de lâmpada com espécies não-alvo relacionadas em gel de agarose e visualizada em gel de 1% de agarose. L, Ladder; 1, Phytophthora sansomeana; 2, Phytophthora sojae; 3, Phytophthora cinnamomi; 4, Phytophthora palmivora; 5, Pythium ultimum var. ultimum; 6, Vexanos de Fitoitótio; 7, Controle negativo; 8, Phytophthora capsica. (B) RESULTADOS DA LÂMPADA visualizados utilizando o corante colorimétrico. 1, Phytophthora sansomeana; 2, Phytophthora sojae; 3, Phytophthora cinnamomi; 4, Phytophthora palmivora; 5, Pythium ultimum var. ultimum; 6, Vexanos de Fitoitótio; 7, Controle negativo; 8, Resultados da LÂMPADA Phytophthora capsici (C) visualizados no gráfico de amplificação. Vermelho = Phytophthora capcisi, todas as outras amostras de espécies não-alvo não foram amplificadas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Imagens que mostram a amostragem e o processamento de água reciclada para a detecção de Phytophthora capsici no campo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Resultados da detecção in loto de Phytophthora capsici em fontes de água de irrigação. (A) Gel de agarose mostrando resultados da amplificação de lâmpada de água testada de sete fazendas na Geórgia do Sul. Nomes da amostra da esquerda para a direita: P1, P2, P3, P4, P5, P6, P7, Controle Negativo, N. (B) RESULTADOS DA LÂMPADA visualizados utilizando corante colorido de partida quente de amostras de campo: P1, P2, P3, P4, P5, P6, P7, Controle Negativo, N. (C) Resultados da amplificação de lâmpadas de amostras de campo utilizando gráfico. Vermelho: P1, Verde: P2, Roxo: P3, Amarelo: P4, Azul: P5, Laranja: P6, Rosa: P7, Controle Negativo, N. (D) Gel de agarose mostrando os resultados convencionais do PCR da amplificação usando primers específicos PC-1/PC-2 (nota que apenas um site testou positivo em comparação com três em LAMP). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Nome da lagoa | Condado de County | Culturas-alvo para irrigação | Detecção de PCR | Detecção de LÂMPADAS | História da Doença (Y/N) |
| P1 | Tift | Vegetais | | + | N |
| P2 | Tift | Vegetais | - | - | N |
| P3 | Tift | Vegetais | - | - | N |
| P4 | Tift | Vegetais | + | + | N |
| P5 | Tift | Vegetais | - | - | N |
| P6 | Tift | Vegetais | - | + | N |
| P7 | Tift | Vegetais | - | - | N |
Tabela 1: Detecção de água de irrigação do Sul ga.
| Tipo de primer | Nome do primer | Sequência 5'-3' | Fonte | ||
| Lâmpada | PCA3-F3 | TGTGTGTGTGTTCGATCACA | Este estudo | ||
| PCA3-B3 | TTTTTGCGTGTCCAGA | Este estudo | |||
| PCA3-FIP | GACACCAAGCACTCGTACTOGTTTTTACAATTGTGCAGAGGGAGGA | Este estudo | |||
| PCA3-BIP | AGAACGAGTATTCGGCGGCTTGAAAAAAGGACCACCCCCG | Este estudo | |||
| PCA3-LF | TGTCGAATGGATTTGCGATCTT | Este estudo | |||
| PCA3-LB | ATACGCAGGTCATTTGACTGAC | Este estudo | |||
| Pcr | PC-1 | GTCTTGTACCCTATCATGGCG | Zhang et al., 2006 | ||
| PC-2 | CGCCACAGCAGGAAAAGCATT | Zhang et al., 2006 | |||
Tabela 2: Primers utilizados neste estudo.
| Parâmetros | Tradicional | PCR convencional | Lâmpada |
| Sensibilidade | NA | 4.8 X 102 esporos/ml | 1.2 X 102 esporos/ml |
| Hora | 2 semanas ou mais | 2-3 horas (sem incluir extração de DNA) | 30 minutos - 1 hora (sem incluir extração de DNA) |
| Preparação | • Criação de mídia • Chapeamento e isolamento e • Projetando uma armadilha |
• Coleção de esporos usando papel filtro • Extração de DNA e • Ensaio pcr |
• Coleção de esporos usando papel filtro • Extração de DNA e • Ensaio de lâmpada |
| Materiais | • Autoclave • Mídia e placas • Sala de incubação • Capa de fluxo • Berinjela • Caixa de leite |
• Ciclofaixa térmica • Gel de ágar • Gel Doc |
• Bloco de calor ou • Gênio III |
| Custo | $5,00 por armadilha | $0,60 por reação | $0,75 por reação |
Tabela 3: Comparação dos métodos de detecção de P. capsici.
Figura suplementar 1: Localização do Condado de Tift, GA e amostras de água de irrigação retiradas de vários locais de dentro do estado. Amostras positivas foram mostradas como pontos vermelhos. Clique aqui para baixar este número.
Figura suplementar 2: Projeto do conjunto de primer LAMP. As setas mostram a direção de como os primers são lidos. Clique aqui para baixar este número.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
O teste da água de irrigação para fitopatógenos é um passo crucial para os produtores que utilizam lagoas de irrigação e água reciclada27. As lagoas de irrigação fornecem um reservatório e um terreno fértil para uma série de fitopatógenos, uma vez que o excesso de água de irrigação é direcionado do campo para a lagoa carregando consigo quaisquer patógenos que possam ter estado presentes16,,27. O método tradicional de detecção de patógenos vegetais em uma grande fonte de água é definir uma isca para o patógeno usando tecido hospedeiro suscetível (por exemplo, frutas, folhas) suspensos na lagoa e esperar que uma infecção ocorra, em seguida, remover as frutas/folhas e confirmar o diagnóstico com microscopia ou métodos moleculares13,14. Esses métodos são limitados devido à quantidade de tempo necessário para executar o teste de detecção (2 semanas ou mais), e o trabalho e equipamento necessários. Além disso, é necessária ampla experiência e conhecimento em diagnóstico visual, morfologia patógena e taxonomia para resultados precisos. Técnicas moleculares como PCR, qPCR e hibridização de DNA requerem significativamente menos tempo (3-4 h) do que os métodos tradicionais de detecção; no entanto, eles exigem equipamentos caros e um ambiente de laboratório. Além disso, essas técnicas não permitem o processamento de grandes volumes de água. Ensaios sorológicos também, estão aquém de sua capacidade de detecção devido a reações positivas não-alvo, e nenhum ensaio específico de espécies para espécies de Phytophthora foi desenvolvido. A amplificação isotérmica mediada por loop (LAMP) tem sido recentemente usada como uma técnica de diagnóstico no local para detecção rápida e sensível de múltiplos patógenos, pois o ensaio requer apenas uma única temperatura em vez de um cicloviário térmico28,,29. A LÂMPADA pode ser executada no campo usando um corante colorimétrico para confirmação visual ou usando uma máquina de amplificação em tempo real para resultados em menos de uma hora30.
O objetivo deste experimento foi desenvolver um método rápido e sensível para detectar a presença de Phytophthora capsici em fontes de água no local ou em laboratório. Para aumentar a velocidade de detecção e combater as limitações dos métodos mencionados anteriormente para detectar P. capsici na água de irrigação, projetamos um método usando papel filtro para capturar os esporos e extrair seu DNA de um volume maior de água. Depois que os esporos foram capturados usando a técnica de papel filtro e o DNA foi extraído, a presença do patógeno foi confirmada com base em um recém-projetado conjunto de primer LAMP específico para P. capsici. A sensibilidade e especificidade de detecção foram comparadas utilizando LÂMPADA e PCR. Em todas as 3 replicações e com todas as concentrações de zoospore, o LAMP foi um método de detecção mais rápido e sensível(Tabela 3). Este método não se limita por ter um pequeno volume amostral como métodos tradicionais, pois este método pode ser testado até 1 L de água em um único momento, aumentando as chances de detecção de patógenos. Observou-se em testes que derramar água de irrigação lentamente através do funil Buchner a uma velocidade de não mais de 40 mL por segundo aumentou a capacidade de captura de esporos do papel filtro.
Para validar o protocolo de detecção, também foram colhidas amostras de água do campo onde suspeitava-se que P. capsici estivesse presente (Figura Suplementar 1) para testar o método projetado com um cenário prático. Das 7 fazendas testadas, 3 foram positivas para a presença de P. capsici utilizando o ensaio LAMP (Figura 6A-6C), enquanto apenas uma fazenda foi positiva ao usar o ensaio PCR convencional(Figura 6D),mostrando lamp como um ensaio mais sensível para este método de teste de água de irrigação. Embora, este ensaio de lâmpada baseado em filtro poderia detectar DNA de uma concentração tão baixa quanto 1,2 x 102 zoospores/mL que foi significativamente menor do que a sensibilidade original deste ensaio (0,01 ng DNA genômico equivalente a ~5 esporos) com suspensão zoospora não filtrada. O ensaio anterior da LAMP por Dong et. al. (2015)20 foi executado na mesma diluição serial e o nível de sensibilidade foi o mesmo (Figura 2F). O nível de detecção de um ensaio PCR com solução de esporo não filtrado também mostrou um nível mais alto de detecção (equivalente ~10 esporos) que foi muito semelhante aos achados anteriores baseados em PCR10. O limite de detecção de esporos do método tradicional de detecção de isca não foi verificado, pois um único esporo poderia causar infecção dependendo de sua capacidade individual. A diminuição da sensibilidade encontrada nos ensaios LAMP e PCR é provavelmente devido a alguns esporos que fluem através ou ao redor do papel filtro, ou uma vez ligados ao papel filtro, incapazes de serem extraídos com 100% de eficiência. No entanto, este novo sistema de LÂMPADA e filtro pode processar e analisar um volume de água muito maior do que os métodos anteriores e confere um maior nível de especificidade e velocidade para detecção em campo.
Dos métodos de extração utilizados, a extração baseada em contas magnéticas foi a mais rápida e não exigiu o uso de máquinas externas, como um batedor de contas ou centrífuga, tornando-o útil para extrações em campo e complementa a característica portátil do ensaio LAMP. O método baseado em CTAB produziu a maior concentração de DNA, mas levou o maior tempo, enquanto o kit de extração de DNA de planta comercial (por exemplo, DNeasy) foi o segundo em ambos os tempos necessários e a concentração de DNA adquirida.
Tanto com o CTAB quanto com o kit de extração de DNA da planta comercial, durante a homogeneização do papel filtro observou-se que a homogeneização foi mais bem sucedida e produziu maior concentração se a solução CTAB (ou tampão de extração) fosse adicionada ao tubo com os pedaços de papel filtro antes do início da batida das contas ou da homogeneização das mãos. A batida de contas foi feita 3 vezes por um minuto cada, mas vórtice e agitação do tubo entre cada rodada foi necessário para a homogeneização completa em todos os métodos de extração. É importante ressaltar que o papel filtro está sujeito a ficar preso nas laterais ou na parte inferior do tubo, por isso é crucial certificar-se de que o papel filtro está fora das paredes para que ele fique homogeneizado.
O tempo total necessário para a amplificação é de 90-120 min e pode ser facilmente feito em campo para o diagnóstico no local. Este método de filtro também foi projetado para filtrar quantidades significativas de água para aumentar as possíveis chances de detecção do patógeno. Este método também é aplicável a muitos patógenos que podem se acumular em uma fonte de água, particularmente gêneros como: Pitium, Fitohthora, Fusariume bactérias; a única mudança necessária será o desenvolvimento de um primer LAMP igualmente específico definido para o patógeno alvo30.
Uma saída significativa deste trabalho é o desenvolvimento de um ensaio de lâmpada baseado em papel de filtro altamente sensível e rápido para a detecção de P. capsici em fontes de água de irrigação. Esperamos que este estudo leve a um aumento na conscientização sobre a contaminação da água de irrigação reciclada, eventualmente melhorando o manejo das doenças associadas ao Phytophthora e, consequentemente, reduzindo os custos de produção e aumentando o rendimento das culturas. Essas informações são altamente necessárias para melhorar a sustentabilidade da produção vegetal e aumentar a rentabilidade das produções vegetais.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm nada a revelar ou conflitos de interesse.
Acknowledgments
Este trabalho recebeu o apoio financeiro da Georgia Commodity Commission for Vegetables project ID# FP000016659. Os autores agradecem ao Dr. Pingsheng Ji, universidade da Geórgia e à Phytophthora sppDra. Agradecemos também li Wang e Deloris Veney por sua assistência técnica durante todo o estudo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose gel powder | Thomas Scientific | C997J85 | |
| Buchner funnel | Southern Labware | JBF003 | |
| Bullet Blender | Next Advance | BBX24 | |
| Centrifuge 5430 | Eppendorf | 22620509 | |
| Chloroform | Fischer Scientific | C298-500 | |
| CTAB solution | Biosciences | 786-565 | |
| Dneasy Extraction Kit | Qiagen | 69104 | |
| Filter Flask | United | FHFL1000 | |
| Filter Paper | United Scientific Supplies | FPR009 | |
| Gel Green 10000X | Thomas Scientific | B003B68 (1/EA) | |
| Genie III | OptiGene | ||
| Hand pump | Thomas Scientific | 1163B06 | |
| Iso-amyl Alcohol | Fischer Scientific | BP1150-500 | |
| LAVA LAMP master mix | Lucigen | 30086-1 | |
| Magnetic bead DNA extraction | Genesig | genesigEASY-EK | |
| Magnetic Separator | Genesig | genesigEASY-MR | |
| polyvinylpyrrolidone | Sigma Aldrich | PVP40-500G | |
| Primers | Sigma Aldrich | ||
| Prism Mini Centrifuge | Labnet | C1801 | |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | |
| UV Gel Doc | Analytik Jena | 849-00502-2 | |
| Warmstart Colorimetric Dye | Lucigen | E1800m | |
| Wide Mini ReadySub-Cell GT Cell | Bio-Rad | 1704489EDU | |
| 70% isopropanol | Fischer Scientific | A451-1 |
References
- Hong, C., Moorman, G. J. Plant pathogens in irrigation water: challenges and opportunities. Critical Reviews in Plant Sciences. 24 (3), 189-208 (2005).
- Malkawi, H. I., Mohammad, M. J. Physiology, Genetics, Morphology, & Microorganisms, E. o. Survival and accumulation of microorganisms in soils irrigated with secondary treated wastewater. Journal of Basic Microbiology. 43 (1), 47-55 (2003).
- Bush, E. A., Hong, C., Stromberg, E. L. Fluctuations of Phytophthora and Pythium spp. in components of a recycling irrigation system. Plant Disease. 87 (12), 1500-1506 (2003).
- Ghimire, S. R., et al. Distribution and diversity of Phytophthora species in nursery irrigation reservoir adopting water recycling system during winter months. Journal of Phytopathology. 159 (11-12), 713-719 (2011).
- Hausbeck, M. K., Lamour, K. H. Phytophthora capsici on vegetable crops: research progress and management challenges. Plant Disease. 88 (12), 1292-1303 (2004).
- Gevens, A., Donahoo, R., Lamour, K., Hausbeck, M. Characterization of Phytophthora capsici from Michigan surface irrigation water. Phytopathology. 97 (4), 421-428 (2007).
- Thomson, S., Allen, R. Occurrence of Phytophthora species and other potential plant pathogens in recycled irrigation water. Plant Disease Reporter. 58 (10), 945-949 (1974).
- Lamour, K. H., Stam, R., Jupe, J., Huitema, E. The oomycete broad-host-range pathogen Phytophthora capsici. Journal of Molecular Plant Pathology. 13 (4), 329-337 (2012).
- Sanogo, S., Ji, P. Water management in relation to control of Phytophthora capsici in vegetable crops. Agricultural Water Management. 129, 113-119 (2013).
- Zhang, Z., Li, Y., Fan, H., Wang, Y., Zheng, X. Molecular detection of Phytophthora capsici in infected plant tissues, soil and water. Plant Pathology. 55 (6), 770-775 (2006).
- Trout, C., Ristaino, J., Madritch, M., Wangsomboondee, T. Rapid detection of Phytophthora infestans in late blight-infected potato and tomato using PCR. Plant Disease. 81 (9), 1042-1048 (1997).
- Sankaran, S., Mishra, A., Ehsani, R., Davis, C. A review of advanced techniques for detecting plant diseases. Commputers and Electronics in Agriculture. 72 (1), 1-13 (2010).
- Wang, Z., et al. Development of an improved isolation approach and simple sequence repeat markers to characterize Phytophthora capsici populations in irrigation ponds in southern Georgia. Applied and Environmental Microbiology. 75 (17), 5467-5473 (2009).
- Ali-Shtayeh, M., MacDonald, J. Occurrence of Phytophthora species in irrigation water in the Nablus area (West Bank of Jordan). Phytopathologia Mediterranea. , 143-150 (1991).
- Pringsh, P. Comparison of serological and culture plate methods for detecting species of Phytophthora, Pythium, and Rhizoctonia in ornamental plants. Plant Disease. 74 (9), 655 (1990).
- Stewart-Wade, S. M. Plant pathogens in recycled irrigation water in commercial plant nurseries and greenhouses: their detection and management. Irrigation Science. 29 (4), 267-297 (2011).
- Aragaki, M., Uchida, J. Y. Morphological distinctions between Phytophthora capsici and P. tropicalis sp. nov. Mycologia. 93 (1), 137-145 (2001).
- Tomlinson, J., Boonham, N. Potential of LAMP for detection of plant pathogens. CAB Reviews Perspectives in Agriculture Veterinary Science Nutrition and Natural Resources. 3 (066), 1-7 (2008).
- Li, P., et al. A PCR-based assay for distinguishing between A1 and A2 mating types of Phytophthora capsici. Journal of the American Society for Horticultural Science. 142 (4), 260-264 (2017).
- Dong, Z., et al. Loop-mediated isothermal amplification assay for sensitive and rapid detection of Phytophthora capsici. Canadian Journal of Plant Pathology. 37 (4), 485-494 (2015).
- Khan, M., et al. Comparative evaluation of the LAMP assay and PCR-based assays for the rapid detection of Alternaria solani. Frontiers in Microbiology. 9, 2089 (2018).
- Sowmya, N., Thakur, M., Manonmani, H. K. Rapid and simple DNA extraction method for the detection of enterotoxigenic Staphylococcus aureus directly from food samples: comparison of PCR and LAMP methods. Journal of Applied Microbiology. 113 (1), 106-113 (2012).
- Waliullah, S., et al. Comparative analysis of different molecular and serological methods for detection of Xylella fastidiosa in blueberry. PLOS ONE. 14 (9), 0221903 (2019).
- Böhm, J., et al. Real-time quantitative PCR: DNA determination in isolated spores of the mycorrhizal fungus Glomus mosseae and monitoring of Phytophthora infestans and Phytophthora citricola in their respective host plants. Journal of Phytopathology. 147, 409-416 (1999).
- Klimczak, L., Prell, H. J. C. Isolation and characterization of mitochondrial DNA of the oomycetous fungus Phytophthora infestans. Current Genetics. 8 (4), 323-326 (1984).
- Ghimire, S. R., et al. Detection of Phytophthora species in a run-off water retention basin at a commercial nursery in plant hardiness zones 7 b of Virginia in winter. Phytopathology. 96 (6), (2006).
- Feng, W., Hieno, A., Kusunoki, M., Suga, H., Kageyama, K. J. P. LAMP detection of four plant-pathogenic oomycetes and its application in lettuce fields. Plant Disease. 103 (2), 298-307 (2019).
- Aglietti, C., et al. Real-time loop-mediated isothermal amplification: an early-warning tool for quarantine plant pathogen detection. AMB Express. 9 (1), 50 (2019).
- Almasi, M. A. Development of a colorimetric loop-mediated isothermal amplification assay for the visual detection of Fusarium oxysporum f. sp. melonis. Horticultural Plant Journal. 5 (3), 129-136 (2019).
- Gill, D. J. Pathogenic Pythium from irrigation ponds. Plant Disease Reporter. 54 (12), 1077-1079 (1970).
