Summary
Wir haben eine Methode entwickelt, um Phytophthora capsici zoospores in Wasserquellen mit einer Filterpapier-DNA-Extraktionsmethode in Verbindung mit einem schleifenvermittelten isothermen Amplifikationstest (LAMP) zu detektieren, der im Feld oder im Labor analysiert werden kann.
Abstract
Phytophthora capsici ist ein verheerender Oomycete-Erreger, der viele wichtige solanaceous und cucurbit Kulturen betrifft, die erhebliche wirtschaftliche Verluste in der Gemüseproduktion jährlich verursachen. Phytophthora capsici ist bodenbedingt und aufgrund seiner langlebigen Überlebensstrukturen (Oosporen und Chlamydosporen), die Witterung und Degradation widerstehen, ein anhaltendes Problem auf Gemüsefeldern. Die Hauptmethode der Dispersion ist durch die Herstellung von Zoosporen, die einzellig sind, flagellated Sporen, die durch dünne Wasserschichten auf Oberflächen oder in wassergefüllten Bodenporen schwimmen können und in Pfützen und Teichen ansammeln können. Daher können Bewässerungsteiche eine Quelle des Erregers und der Anfangspunkte von Krankheitsausbrüchen sein. Der Nachweis von P. capsici in Bewässerungswasser ist mit traditionellen kulturbasierten Methoden schwierig, da andere Mikroorganismen, die in der Umwelt vorkommen, wie Pythium spp., in der Regel P. capsici überwuchern, was es nicht nachweisbar macht. Um das Vorhandensein von P. capsici-Sporen in Wasserquellen (Bewässerungswasser, Abflusses usw.) zu bestimmen, haben wir ein Handpumpen-basiertes Filterpapier (8-10 m) entwickelt, das die Sporen des Erregers (Zoosporen) erfasst und später verwendet wird, um die DNA des Erregers durch eine neuartige, schleifenvermittelte isotherme isotherme Amplifikation (LAMP) zu verstärken. Diese Methode kann DNA aus einer Konzentration von bis zu 1,2 x 102 Zoosporen/ml verstärken und detektieren, was 40-mal empfindlicher ist als herkömmliche PCR. Bei der Prüfung eng verwandter Arten wurde keine Kreuzverstärkung erreicht. LAMP wurde auch mit einem kolorimetrischen LAMP-Master-Mix-Farbstoff durchgeführt, der Ergebnisse anzeigte, die mit bloßem Auge für die schnelle Erkennung vor Ort gelesen werden konnten. Dieses Protokoll könnte an andere Krankheitserreger angepasst werden, die sich über kontaminierte Bewässerungssysteme aufhalten, ansammeln oder dispergieren.
Introduction
Das Recycling von Wasser in landwirtschaftlichen Betrieben und Baumschulen wird aufgrund der steigenden Wasserkosten und der Umweltbedenken hinter der Wassernutzung immer beliebter. Viele Bewässerungsmethoden wurden für Züchter entwickelt, um die Ausbreitung und das Auftreten von Pflanzenkrankheiten zu reduzieren. Unabhängig von der Quelle des Wassers (Bewässerung oder Niederschlag) wird Abflusses erzeugt, und viele Gemüse- und Gärtnereien haben einen Teich, um Abflusses zu sammeln und zu recyceln1. Dadurch entsteht ein Reservoir für eine mögliche Anhäufung von Krankheitserregern, die die Ausbreitung von Krankheitserregern begünstigt, wenn das recycelte Wasser zur Bewässerung von Pflanzen2,3,4verwendet wird. Oomycete Pflanzenpathogene profitieren besonders von dieser Praxis, da Zoosporen sich im Wasser ansammeln und die primäre dispersive Sporen ist selbst-motil, erfordert aber Oberflächenwasser5,6,7. Phytophthora capsici ist ein Oomycete-Erreger, der eine erhebliche Anzahl von solanaceous und Cucurbit Kulturen in verschiedenenWeisen8 betrifft. Oft sind die Symptome Dämpfung von Sämlingen, Wurzel und Krone Fäulnis; Bei Kulturen wie Gurke, Kürbis, Melone, Kürbis, Wassermelone, Auberginen und Pfeffer können jedoch ganze Ernten durch Fruchtfäule verloren gehen9. Obwohl es bekannte Methoden zum Nachweis dieses Pflanzenerregers gibt, benötigen die meisten eine Infektion, die bereits stattgefunden hat, was zu spät ist, damit irgendwelche präventiven Fungizide eine signifikante Wirkung haben10.
Die traditionelle Methode, Bewässerungswasser für den Nachweis und die Diagnose von gezielten Mikroorganismen zu testen, ist ein antiquierter Ansatz, wenn Geschwindigkeit und Empfindlichkeit entscheidend für den Erfolg und profitable Pflanzenproduktion sind11,12. Pflanzengewebe, das für den gezielten Erreger empfänglich ist (z. B. Auberginen für P. capsici), wird an einer modifizierten Falle befestigt, die über einen längeren Zeitraum in einem Bewässerungsteich aufgehängt wird, bevor sie entfernt und auf Infektionen untersucht wird. Proben aus dem Pflanzengewebe werden dann auf semiselektiven Medien (PARPH) plattiert und für das Kulturwachstum inkubiert, dann wird die morphologische Identifizierung mit einem zusammengesetzten Mikroskop13durchgeführt. Es gibt andere ähnliche Nachweismethoden für andere Pflanzenpathogene, die selektive Medien verwenden und kleine Mengen kontaminierten Wassers plattieren, bevorsie 14,15sub-culturing sub-culturing. Diese Methoden erfordern zwischen 2 und 6 Wochen, mehrere Unterkultivierungsrunden, um den Organismus zu isolieren, und Erfahrung mit Phytophthora-Diagnostik, um die wichtigsten morphologischen Charaktere jeder Art erkennen zu können. Diese traditionellen Methoden eignen sich nicht gut für den Nachweis von Bewässerungswasser, das durch P. capsici aufgrund von Faktoren wie Interferenzen durch andere Mikroorganismen kontaminiert ist, die auch in den Wasserquellen vorhanden sind. Einige schnell wachsende Mikroorganismen wie Pythium spp. und wassergetragene Bakterien können auf der Platte überwuchern, so dass P. capsici nicht nachweisbar16,17.
Der Zweck dieser Studie war die Entwicklung einer empfindlichen und spezifischen molekularen Methode, die sowohl in Feld- als auch laboratoriumsspezifischen Umgebungen zum Nachweis von P. capsici Zoosporen im Bewässerungswasser verwendet werden kann. Das Protokoll beinhaltet die Entwicklung eines neuartigen schleifenvermittelten isothermen Amplifikations-Primers (LAMP)-Primers, das in der Lage ist, P. capsicispezifisch zu verstärken, basierend auf einem 1121-Basenpaar (bp) Fragment von P. capsici18,19. Ein zuvor entwickelter LAMP Primer von Dong et al. (2015) wurde im Vergleich zu dem für diese Studie entwickelten Test verwendet20.
Der LAMP-Assay ist eine relativ neue Form der molekularen Detektion, die nachweislich schneller, empfindlicher und spezifischer ist als herkömmliche Polymerase-Kettenreaktion (PCR)21. Im Allgemeinen können herkömmliche PCR-Assays nicht unter 500 Kopien (1,25 pg/l) erkennen; Im Gegensatz dazu haben frühere Studien gezeigt, dass die Empfindlichkeit von LAMP 10 bis 1.000 Mal höher sein kann als herkömmliche PCR und leicht sogar 1 fg/l genomische DNA22,23erkennen kann. Darüber hinaus kann der Test schnell (oft in 30 min) und vor Ort (im Feld) mit einem tragbaren Heizblock für die Verstärkung und einem kolorimetrischen Farbstoff durchgeführt werden, der die Farbe für eine positive Probe ändert (wodurch die Elektrophorese entfällt). In dieser Studie haben wir die Empfindlichkeit von PCR- und LAMP-Assays mit einer Filterextraktionsmethode verglichen. Die vorgeschlagene Nachweismethode ermöglicht es Forschern und Erweiterungsmitteln, das Vorhandensein von P. Capsici-Sporen aus verschiedenen Wasserquellen in weniger als zwei Stunden leicht zu erkennen. Der Test ist nachweislich empfindlicher als herkömmliche PCR und wurde vor Ort durch den Nachweis des Vorhandenseins des Erregers in dem von einem Züchter verwendeten Bewässerungswasser validiert. Diese Nachweismethode wird es den Züchtern ermöglichen, das Vorhandensein und die Populationsdichte des Erregers in verschiedenen Wasserquellen zu schätzen, die für die Bewässerung verwendet werden, wodurch verheerende Ausbrüche und wirtschaftliche Verluste verhindert werden.
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Protocol
1. Vor-Ort-Nachweis von Phytophthora capsici aus Bewässerungswasser mittels tragbarer, schleifenvermittelter isothermaler Amplifikation
- Einrichten der Pumpe und des Filters
- Befestigen Sie einen Filterkolben an einem Rohr, das mit einer Handpumpe verbunden ist, so dass bei Aktivierung der Pumpe Luft durch den Mund des Filterkolbens eingezogen wird.
- Den Buchner-Trichter in den Gummistopfen in den Mund des Filterkolbens einbauen und das entsprechend große Stück Filterpapier in den Buchner-Trichter einbauen, so dass Luft durch das Filterpapier gezogen wird. Das Filterpapier sollte eine Retentionsgröße von 15 m haben.
HINWEIS: Das Filterpapier muss an den Rändern des Buchner-Trichters passen, damit nur wenig Wasser um das Filterpapier fließt.
- Wasserprobenahme und -filterung
- Nehmen Sie Wasserproben aus der Zielquelle. Wasser kann kleine Mengen an Schutt haben, aber nicht signifikante Sedimente oder Boden.
- Gießen Sie bis zu 1.000 ml (1 Liter) Testwasser langsam genug über das im Buchner-Trichter platzierte Filterpapier, um einen Überlauf zu verhindern, während die Handpumpe (oder das Vakuum) verwendet wird, um eine Absaugung zu erzeugen, um das Wasser durchzuziehen.
HINWEIS: Es gibt keine Mindestmenge an Wasser, die mit dieser Methode getestet werden kann, und obwohl es mindestens 50 ml vorgeschlagen wird, ist 1000 ml das Maximum für diese Methode. - Mit Zangen das Filterpapier aus dem Buchner-Trichter entfernen und mit einer sterilen Schere in kleine Stücke schneiden. Fügen Sie so viele Stücke (8-12) hinzu, wie in die Menge des Extraktionspuffers (400 l für die magnetische Perlenextraktion) eingetaucht werden können, die das Protokoll in ein 1,5 ml-Rohr einfügt. Speichern Sie die verbleibenden Teile des Filterpapiers für die Verarbeitung, nachdem der erste Satz extrahiert wurde.
- Wirbel oder anderweitig agitieren die Stücke von Filterpapier und Extraktionspuffer für 10 s pro Minute für 5 min. Entfernen Sie dann mit Zangen das Filterpapier, das so wenig wie möglich vom Extraktionspuffer verliert. Wiederholen Sie diesen Schritt mit den restlichen Stücken Filterpapier, bis alle Teile gewirbelt/gerührt und im Extraktionspuffer eingeweicht wurden.
- Magnetische Perlen-basierte Extraktion von DNA aus Filterpapier
- In das 1,5 ml-Rohr (das nun ca. 200-300 l Extraktionspuffer enthält) 20 l Proteinase K und 10 l mit 10 ng/l RNase hinzufügen.
- Bei Raumtemperatur 15 min inkubieren, Wirbel oder schütteln Sie das Rohr alle 3 min.
- Fügen Sie der Probe 500 l Magnetperlen mit dem Bindungspuffer hinzu und mischen Sie sie durch Schütteln gut. Dann für 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
- Legen Sie das Rohr 2 min in das Magnetabscheidergestell, bis alle Perlen an den Magneten gezogen wurden. Entfernen und entsorgen Sie den Überstand.
- Entfernen Sie das Rohr aus dem magnetischen Separator. Fügen Sie 500 l Waschpuffer 1 hinzu und hängen Sie die Perlen erneut auf, indem Sie das Rohr kräftig schütteln. Warten Sie 30 s und legen Sie das Rohr dann wieder in den magnetischen Separator. Warten Sie 2 min, bis alle Perlen zum Magneten gezogen wurden, bevor Sie den Überstand entfernen und entsorgen.
HINWEIS: Wenn Sie darauf warten, dass die magnetischen Perlen auf den Separator magnetisieren, empfehlen wir, das Rohr umzukehren, das magnetische Perlen, die an der Kappe und den Seiten des Rohres kleben und dazu führen können, dass eine größere Anzahl von Perlen angebracht wird, auflösen kann. - Wiederholen Sie Schritt 1.3.5 mit 500 l Waschpuffer 2.
- Wiederholen Sie Schritt 1.3.5 mit 500 l 80% Ethanol.
- Das magnetische Perlenpellet 15 min bei Raumtemperatur (18-27 °C) mit geöffnetem Deckel austrocknen. Wenn die Temperaturen es nicht zulassen, in einer handgeliebten Hand mit der Kappe für 15 min geöffnet inkubieren.
- Entfernen Sie das Rohr aus dem magnetischen Separator. Fügen Sie 50 l Elutionspuffer hinzu und hängen Sie die Perlen erneut auf, indem Sie 1 min nach oben und unten pfeifen.
- Legen Sie das Rohr wieder in einen magnetischen Separator. Warten Sie 2 min, bevor Sie den Überstand übertragen, ohne die Perlen in eine separate Röhre zur DNA-Speicherung zu stören.
HINWEIS: Hier kann das Experiment angehalten werden, bevor Es weitergeht. Die extrahierte DNA sollte auf Eis oder in einem Gefrierschrank von -20 °C gelagert werden.
- Anwendung des neu entwickelten LAMP-Assays
- Bereiten Sie den LAMP-Primer-Mix mit 0,2 m pro F3- und B3-Grundierung, 0,8 m pro Loop-F- und Loop-B-Primer und 1,6 m pro FIP- und BIP-Primer vor (Tabelle 2).
- Fügen Sie die folgende LAMP-Lösung zu einem einzelnen PCR-Rohr oder zu jedem einzelnen Rohr in der 8-Rohr-Streifen: 2,5 l Primer-Mix (Schritt 1.4.1), 12,5 l LAVA LAMP-Master-Mix, 1 l extrahierte DNA und 9 l ddH2O. Das Gesamtvolumen beträgt 25 L.
HINWEIS: Wenn Sie das tragbare Verstärkungsinstrument (z. B. Genie III) mit farbmetrischem Farbstoff (z. B. Warmstart) verwenden, lesen Sie Abschnitt 2.4.2- 2.4.3. - Bezeichnen Sie zwei Röhren als positive und negative Kontrollen. Verwenden Sie für die Positivkontrolle entweder eine Kontrolle des LAVA LAMP-Kits oder eine bekannte positive DNA-Probe. Verwenden Sie für die Negativkontrolle ddH2O. Bei beiden die extrahierte DNA mit 1 l durch 1 l der Positivkontrolle oder ddH2O ersetzen.
- Stellen Sie die Proben in einen Wärmeblock (oder ein tragbares Verstärkergerät) ein, das für 45 min auf 64 °C eingestellt ist.
HINWEIS: Anstelle der magnetischen Perlenextraktion können hier andere Extraktionsmethoden verwendet werden. CTAB und ein kommerzielles DNA-Extraktionskit wurden beide erfolgreich mit den Standardprotokollen getestet und ersetzten die Filterpapierstücke für die Pflanzenprobe24,25. Die Ergebnisse wurden in Tabelle 2verglichen. Wenn die Konzentration der DNA quantifiziert werden kann, verwenden Sie zwischen 1-10 ng genomische DNA.
- Visualisierung der Ergebnisse
- Wenn sie in einer Laborumgebung durchgeführt werden, betrachten Sie die Amplifikationsprodukte, indem Sie 5 l jeder Probe in ein 1% Agarose-Gel laden, sie in einer Gelelektrophoresemaschine laufen lassen und sie in einer UV-Bildgebungsmaschine ausbilden.
- Wenn ein farbmetrischer Farbstoff (z. B. Warmstart) verwendet wurde, zeigen Sie die Farbänderung an, um die Ergebnisse als positiv oder negativ zu bestimmen.
- Wenn ein tragbares Verstärkungsinstrument (z. B. Genie III) verwendet wurde, zeigen Sie das Amplifikationsdiagramm auf dem Bildschirm an, um die Ergebnisse zu bestimmen.
- Anwendung von zuvor entwickeltem PCR-Assay
HINWEIS: Bei Verwendung eines herkömmlichen PCR-Assays bleiben die Schritte 1-3 gleich, und die folgenden Schritte sollten anstelle der Schritte 1.4 und 1.5 angewendet werden.- Fügen Sie einzelnen Röhrchen, die die folgenden Komponenten enthalten, 1 l von jeder DNA-Extraktion hinzu: 12,5 l grünen PCR-Master-Mix, 9,5 l ddH2O und 1 l Vorwärts- und Rückwärtsprimer (Tabelle 2).
- Drehen Sie jede Probe mit einer Mikrozentrifuge aus und legen Sie Dier in einen thermischen Cycler.
- Verwenden Sie die folgenden thermischen Cycler-Einstellungen gemäß den vorherigen Veröffentlichungen: 94 °C für 5 min, 30 Denaturierungszyklen bei 94 °C für 30 s, Glühen bei 54 °C für 30 s, Verlängerung bei 72 °C für 1 min und Endverlängerung bei 72 °C für 10 min.
- Führen Sie das Produkt in einem 1% Agarose Gel. Beobachten Sie das Vorhandensein von Bändern unter UV-Licht, wo positive Reaktionen eine Bandgröße von 508 bp haben.
- Traditionelle Erkennungsmethode
HINWEIS: Es gibt mehrere Methoden der selektiven Beschichtung für den Nachweis von Krankheitserregern, und das folgende ist ein allgemeines Protokoll für P. capsici.- Zuerst erhalten Sie eine gesunde Auberginenfrucht (ein anfälliger Wirt für P. capsici)und Oberflächensterilisieren durch Waschen der Fruchtoberfläche mit 70% Isopropylalkohol.
- Die Auberginenfrüchte mit einer Flotationsvorrichtung (Polyethylenschaum oder andere) in Milchkisten geben und in Bewässerungsteichen einsetzen. Sichern Sie jede Köderfalle bis zu einem einzigen Punkt und lassen Sie die Fallen im Wasserreservoir (recyceltes Bewässerungswasser) für mindestens 7 Tage oder bis Fruchtfäule Symptome beobachtet werden. Sammeln Sie die Früchte und transportieren Sie sie ins Labor.
- Spülen und trocknen Sie die Frucht in einer sterilen Haube, bevor Sie kleine Stücke infizierten Gewebes entfernen, und legen Sie sie auf eine Platte parPH-Medium, die mit 25 mg/L Pentachlornitrobenzol, 0,0005% Pimaricin, 250 mg/L Ampicillin, 10 mg/L Rifampicin und 50 mg/L Hymexazol geändert wurde. Teller 5 Tage lang bei 25 °C inkubieren.
- Zeigen Sie Platten unter einem zusammengesetzten Mikroskop zur traditionellen morphologischen Identifizierung 4 Tage nach der Isolierung.
2. Bestimmung der Nachweisgrenze der Zoosporenkonzentration
- Zoospore Suspension machen
- Inkubieren P. capsici auf V8 Agar (100 ml V8 Saft, 900 ml ddH2O, 1 g CaCO3) Platten für 1 Woche bei 26 °C. Mehrere Platten können verwendet werden, um eine größere Menge an Zoosporensuspension zu erhalten.
- Inkubieren Sie die Platten unter kontinuierlichem Licht bei Raumtemperatur für 3 Tage, um die Sporulation zu stimulieren.
- Überfluten Sie die Platten, indem Sie 15 ml ddH2O zu jeder Platte hinzufügen und 25 min in einen 4 °C-Kühlschrank stellen. Dann kehren Sie auf Raumtemperatur für 30 min.
- Agitieren Sie Platten, um Zoosporen zu vertreiben und pipette die Lösung in einem einzigen 50 ml Rohr von allen Platten.
- Um eine genaue Schätzung der Zoosporenkonzentration zu erhalten, fügen Sie 10 l der Sporensuspension auf ein Hämozytometer ein und beobachten Sie unter dem Mikroskop, um Zoosporen zu zählen und die durchschnittliche Konzentration zu schätzen.
- Serielle Verdünnung
- 1 ml der Sporenaufhängung und 9 ml ddH2O in ein separates Rohr geben. Wiederholen Sie diesen Schritt für so viele 10-fache Verdünnungen wie gewünscht.
- Sporenlösungen werden dann zur DNA-Extraktion auf der Grundlage des vorherigen Protokolls mit der Filtrationsmethode eingereicht.
HINWEIS: Wenn ein größeres Volumen der Suspension gewünscht wird, verdoppeln Sie das Volumen: 2 ml Sporenaufhängung und 18 ml ddH2O.
- Nachweis des Konzentrationsgrenzwerts für Zoosporen
- Bewerten Sie die Sporendetektionsgrenze, indem Sie jede serielle Verdünnung einzeln durch den Test ausführen, bis eindeutig positive Ergebnisse nicht mehr beobachtet werden. Sobald die endgültige Verdünnung erreicht ist, um den Faktor 2 (4,8 bis 2,4 in diesem Beispiel) verdünnen und den Testvorgang erneut ausführen, um eine genauere Nachweisgrenze zu erhalten.
- Entwicklung und Optimierung der LAMP-Methode
HINWEIS: DIE LAMP-Primer wurden auf der Grundlage eines 1121-Basenpaars (bp) fragmentierter P. capsici (Li et al.19) entworfen, wie in Der Ergänzenden Abbildung 2dargestellt.- Wenn farbmetrischer Farbstoff (z. B. Warmstart) verwendet wird, verwenden Sie die folgende Lösung: 2,5 l Grundierungsmischung, 12,5 l kolorimetrischen Farbstoffs, 0,5 l grünen Fluoreszenzfarbstoff, 1 ,L extrahierte DNA und 8,5 l ddH2O. Das Gesamtvolumen beträgt 25 L.
- Wenn Sie das tragbare Verstärkungsinstrument mit LAVALAMP Mastermix verwenden, haben Sie einen ersten Schritt von 95 °C für 3 min, wie vom Hersteller empfohlen, aber dies ist nicht erforderlich. Ein letzter Glühschritt ist nicht erforderlich, um den Farbwechsel oder die Verstärkungsgraphie zu beobachten. Führen Sie keinen Warmstartschritt aus, wenn der kommerzielle farbmetrische Farbstoff verwendet werden soll.
- View LAMP Assay ergebnisse in einer der folgenden Methoden: führen Sie Proben auf einem 1% Agarose Gel oder sehen Sie mit einer UV-Bildgebungsmaschine mit dem bloßen Auge oder Blick auf den Genie III Echtzeit-Amplifikationsbildschirm.
- Optimieren Sie die Temperatur des LAMP-Assays mit dem tragbaren Verstärkungsinstrument und analysieren Sie mit dem Echtzeit-Amplifikationsdiagramm auf Geschwindigkeit und Empfindlichkeit. Führen Sie Proben mit einzigartigen Temperaturen durch, um die schnellste Verstärkung mit höchster Empfindlichkeit zu bestimmen.
- Bestimmen Sie die Nachweisgrenze des entwickelten LAMP-Tests, indem Sie eine serielle Verdünnung der extrahierten DNA (wie bei Sporensuspension in Schritt 2.2.1) und die Aufrechterhaltung der Reaktionsbedingungen, wie zuvor für die LAMP-Reaktion für jede Verdünnung beschrieben, festlegen.
- Bestimmung und Vergleich der Nachweisgrenze mit konventioneller PCR-Methode
- Verwenden Sie DNA, die in Schritten in Abschnitt 1.3 extrahiert wurde, um den Nachweisgrad konventioneller PCR mit dem des LAMP-Assays zu vergleichen.
- Fügen Sie einer PCR-Röhre, die sowohl Vorwärts- als auch Rückwärts-PCR-Primer (Tabelle 2),12,5 l grünen PCR-Mastermix und 9,5 l ddH 2 O für insgesamt 25 L enthalten, 1 l DNA hinzu und 9,5 l ddH2O.
- Proben in einem thermischen Cycler unter folgenden Bedingungen verstärken: 94 °C für 5 min, 30 Denaturierungszyklen bei 94 °C für 30 s, Glühen bei 54 °C für 30 s, Verlängerung bei 72 °C für 1 min und Endverlängerung bei 72 °C für 10 min.
- Führen Sie Proben in einer Elektrophoresemaschine auf einem 1% Agarose-Gel und sehen Sie sich eine UV-Bildgebungsmaschine an. Die ausgenommene Bandgröße betrug 508 bp.
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Representative Results
Optimierung der LAMP-Methode
In dieser Studie haben wir das Vorhandensein von Phytophthora capsici im Bewässerungswasser mit einem tragbaren, schleifenvermittelten isothermen Amplifikationstest (LAMP) festgestellt. Zunächst wurde der vorgeschlagene LAMP-Test durch die Prüfung verschiedener LAMP-Primerkonzentrationen optimiert [F3, B3 (jeweils 0,1–0,5 m); LF, LB (je 0,5–1,0 M) und FIP, BIP (je 0,8–2,4 M)], Dauern (30–70 min) und Temperaturen (55–70 °C). Der letzte LAMP-Primer-Mix, der in dieser Studie verwendet wurde, war: 0,2 m pro F3- und B3-Primer, 0,8 m pro Loop-F- und Loop-B-Primer, 1,6 m pro FIP- und BIP-Primer. Die Optimierung der Reaktionstemperatur wurde im tragbaren Verstärkungsinstrument (z.B. Genie III) durchgeführt, indem bestimmt wurde, welche Temperatur die schnellste Reaktion ohne zusätzliche negative Verstärkung ausführte. Die optimale Temperatur wurde auf 64 °C bestätigt (Daten nicht dargestellt). Die optimale Zeit für den Testlauf bei 64 °C betrug 45 min, da die niedrigsten Konzentrationen, die positiv für die Detektion waren (1,2 x 102 Sporen/ml), noch um 40 min verstärkt wurden, während höhere Konzentrationen bei 20 min verstärkt wurden(Abbildung 2D). Die verstärkten LAMP-Produkte wurden weiter an 1% Agarose-Gel beobachtet, das mit einem Nukleinsäurefleck gefärbt war, um die Amplifikation zu bestätigen. Alle Reaktionen wurden mindestens dreimal wiederholt.
Isolate von P. capsici wurden aus Tennessee, Florida und Georgia genommen und dem gleichen Protokoll vorgelegt, das in den Methoden beschrieben wurde. Alle Proben von P. capsici Isolaten wurden in allen Ausführungen des Assays erfolgreich verstärkt (Abbildung 3).
Nachweis und Empfindlichkeitsprüfung von Phytophthora capsici im Bewässerungswasser mit tragbarem LAMP-Assay
Wir standardisierten diese filterpapierbasierte LAMP-Methode unter Laborbedingungen unter Verwendung einer seriellen Verdünnung von P. capsici Sporensuspensionen (Abbildung 1). Serielle Verdünnungen wurden aus einer P. capsici Sporensuspension ab 4,8 x 104 Zoosporen/ml hergestellt und laufen mit dem LAMP-Assay in Dreifacharbeit. Sporenkonzentrationen werden aufgrund der Methode zur DNA-Extraktion gezeigt, anstatt DNA-Konzentrationen. Die CTAB-DNA-Extraktion der höchsten Sporenkonzentration betrug 4,5 ng/l, gemessen mit Nanodrop, und das magnetische Perlen-DNA-Extraktionsprotokoll ergab 3,8 ng/l26. Das neu entwickelte LAMP-Primer-Set konnte eine Konzentration von nur 1,2 x 102 Sporen/ml(Abbildung 2B, 2C und 2D) mit allen Extraktionsmethoden erkennen. Die im Diagramm der Verstärkung auf dem tragbaren Verstärkungsinstrument dargestellte Empfindlichkeit war identisch mit der im UV-Bild ohne zusätzliche Empfindlichkeit dargestellten Empfindlichkeit. Die gleiche serielle Verdünnung wurde in einer LAMP-Reaktion mit dem kolorimetrischen Farbstoff ausgeführt, um den Empfindlichkeitsgrad gegenüber dem bloßen Auge für die Felderkennung zu bestimmen. Die niedrigste beobachtbare Konzentration betrug 4,8 x 103 Sporen/ml (Abbildung 2C).
Um die Fähigkeit dieses Assays anhand von realen Proben zu bewerten, wurden Wasserproben aus sieben Teichen entnommen, die für die kommerzielle Gemüseproduktion in Tift County, Georgia, verwendet wurden(Tabelle 1, Abbildung 5und Ergänzende Abbildung 1). Von den 7 Teichen zeigten 3 positive LAMP-Ergebnisse (P1, P4 und P6) (Abbildung 6A, 6B und 6C). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die tragbare Filterpapier-basierte LAMP-Methode auch bei geringer Zoosporenkonzentration sehr nützlich für den Nachweis des Erregers sein könnte. Dies zeigt die Anwendbarkeit von LAMP als empfindlicherer Detektionstest als PCR zum Abschirmen von Bewässerungswasserkontamination durch P. capsici.
Vergleichende Analyse verschiedener Methoden: Traditionelles Ködern, konventionelle PCR und der tragbare LAMP-basierte Assay
Um die Nachweisempfindlichkeit von LAMP mit der konventionellen PCR zu vergleichen, wurde die aus der seriellen Verdünnung von Sporensuspensionen extrahierte DNA in einer PCR-Reaktion ausgeführt. Die Ergebnisse zeigten, dass herkömmliche PCR 40-fach weniger empfindlich als LAMP waren und nur eine Zoosporenkonzentration von 4,8 x 103 Sporen/ml erkennen konnten (Abbildung 2A). Zusätzlich wurden die DNA-Proben aus gefiltertem Bewässerungsteichwasser mit konventioneller PCR getestet, und nur eine der drei positiven Proben (P4) wurde wie erwartet erfolgreich verstärkt, plus signifikante Verunreinigungen, was zu einigen verschmierten und unspezifischen Bändern führte (Abbildung 6D). Tabelle 3 zeigt die Unterschiede zwischen Erkennungsmethoden unter Verwendung von Variablen wie Zeit, Kosten, Empfindlichkeit und Vorbereitung. LAMP war die kostengünstigste Methode unter diesen drei Methoden und es war auch die schnellste, von 30-60 min für die Amplifikation (DNA-Extraktion ausgeschlossen). Herkömmliche PCR reichten von 120-180 min für die Amplifikation (DNA-Extraktion ausgeschlossen).
Schließlich, um die Spezifität der Primer zu bestimmen, Proben von eng verwandten Oomycete-Erreger (Phytophthora sansomeana, Phytophthora sojae, Phytophthora cinnamomi, Phytophthora palmivora, Pythium ultimum var. ultimum, Phytopythium vexans, Phytopythium helicoides, und Pythium aphanidermatum) wurden erhalten, DNA wurde mit dem gleichen Protokoll für Konsistenz extrahiert und durch den neuen LAMP-Assay mit einer positiven und negativen Kontrolle bewertet (Abbildung 4) zur Bestimmung der Spezifität der Primer. Alle Nicht-Zielproben waren mit den optimierten 64 °C für 45 min negativ. Dies wurde auf der Echtzeit-Amplifikationsgrafik beobachtet und auf einem 1% Agarose-Gel unter UV-Licht abgebildet.
Abbildung 1: Diagramm, das die verschiedenen Schritte zeigt, die an Phytophthora capsici aus einer seriellen Verdünnung einer konzentrierten Sporensuspension unter Laborbedingungen beteiligt sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Laboroptimierung des Grenzwerts für den Nachweis von Phytophthora capsici. (A) Herkömmlicher PCR-Assay wurde mit spezifischen P. Capsici Primern auf serielle verdünnungsfaktoren durchgeführt und auf 1% Agarose-Gel visualisiert. 1, Leiter; 2-7, 4.8 x 104, 4.8 x 103, 4.8 x 102, 2.4 x 102, 1.2 x 102 spores/mL, bzw. 7, negative Wasserkontrolle. (B) LAMP-Assay serielle Verdünnungsfaktoren visualisiert auf 1% Agarose-Gel. 1-6, eine abnehmende Sporenkonzentration: 4,8 x 104, 4,8 x 103, 4,8 x 102, 2,4 x 102, 1,2 x 102 Sporen/ml, und 7, negative Wasserkontrolle. (C) LAMP-Ergebnisse visualisiert mit dem kolorimetrischen Farbstoff. 1-6, eine abnehmende Sporenkonzentration: 4,8 x 104, 4,8 x 103, 4,8 x 102, 2,4 x 102, 1,2 x 102 Sporen/ml, und 7, negative Wasserkontrolle. (D) LAMP-Ergebnisse auf dem Amplifikationsdiagramm visualisiert. Rot = 4,8 x 104, Dunkelblau = 4,8 x 103, Orange = 4,8 x 102, Hellblau = 2,4 x 102, Grün = 1,2 x 102 Sporen/ml, Rosa = Negative Kontrolle (andere Phytophthora-Arten), Gelb = ddH2O. (E) Eine Standardkurve, die die Quantifizierung der in den Echtzeitergebnissen dargestellten Werte anzeigt. Ln (Sporenanzahl) wird auf der X-Achse und Minuten zur Verstärkung auf der Y-Achse angezeigt. (F) LAMP-Assay mit veröffentlichter Grundierung (Dong et al. 2015) über serielle Verdünnungsfaktoren, die auf 1% Agarose-Gel visualisiert werden. 1-6, eine abnehmende Sporenkonzentration: 4,8 x 104, 4,8 x 103, 4,8 x 102, 2,4 x 102, 1,2 x 102 Sporen/ml, und 7, negative Wasserkontrolle. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Amplifikation von P. capsici DNA von verschiedenen Orten. (A) LAMP Ergebnisse visualisiert auf 1% Agarose Gel. 1, PC_TN1; 2, PC_TN2; 3, PC_FL1; 4.PC_FL2; 5, PC_GA1; 6, PC_GA2; N, Negative Kontrolle. Die Proben 1 und 2 wurden von TN isoliert; Proben 3 und 4 isoliert von FL; Die Proben 5 und 6 wurden von GA isoliert. (B) Die Ergebnisse visualisiert mit dem kolorimetrischen Farbstoff. 1, PC_TN1; 2, PCTN2; 3, PC_FL1; 4.PC_FL2; 5, PC_GA1; 6, PC_GA2. (C) Ergebnisse, die auf dem Amplifikationsdiagramm visualisiert werden. Rot, PC_TN1; Orange, PCTN2; Gelb, PC_FL1; Grün, PC_FL2; Dunkelblau, PC_GA1; Hellblau, PC_GA2; Rosa, negative Kontrolle. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Spezifitätsbestimmung des LAMP-Tests mit DNA von Nicht-Zielarten P. capsici. (A) LAMP-Assay-Reaktion mit verwandten Nicht-Ziel-Arten auf Agarose-Gel und visualisiert auf 1% Agarose-Gel. L, Leiter; 1, Phytophthora sansomeana; 2, Phytophthora sojae; 3, Phytophthora cinnamomi; 4, Phytophthora palmivora; 5, Pythium ultimum var. ultimum; 6, Phytopythium vexans; 7, Negative Kontrolle; 8, Phytophthora capsica. (B) LAMP Ergebnisse visualisiert mit dem farbmetrischen Farbstoff. 1, Phytophthora sansomeana; 2, Phytophthora sojae; 3, Phytophthora cinnamomi; 4, Phytophthora palmivora; 5, Pythium ultimum var. ultimum; 6, Phytopythium vexans; 7, Negative Kontrolle; 8, Phytophthora capsici (C) LAMP Ergebnisse visualisiert auf der Amplifikationsgraph. Rot = Phytophthora capcisi, alle anderen Nicht-Ziel-Artenproben wurden nicht verstärkt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Bilder, die die Probenahme und Verarbeitung von recyceltem Wasser zum Nachweis von Phytophthora capsici im Feld zeigen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Ergebnisse des Vor-Ort-Nachweises von Phytophthora capsici in Bewässerungswasserquellen. (A) Agarose-Gel mit Ergebnissen der LAMP-Verstärkung von geprüftem Wasser von sieben Farmen in Südgeorgien. Beispielnamen von links nach rechts: P1, P2, P3, P4, P5, P6, P7, Negative Control, N. (B) LAMP-Ergebnisse visualisiert mit warmstart-Farbtum von Feldproben: P1, P2, P3, P4, P5, P6, P7, Negative Control, N. (C) Ergebnisse aus LAMP-Verstärkung von Feldproben mit Graph. Rot: P1, Grün: P2, Violett: P3, Gelb: P4, Blau: P5, Orange: P6, Pink: P7, Negativkontrolle, N. (D) Agarose Gel zeigt konventionelle PCR-Ergebnisse der Amplifikation mit spezifischen Primern PC-1/PC-2 (Anmerkung als nur eine Seite positiv getestet im Vergleich zu drei in LAMP). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Teichname | County | Zielkulturen für die Bewässerung | PCR-Erkennung | LAMP-Erkennung | Krankheitsgeschichte (Y/N) |
| P1 | Tift | Gemüse | | + | N |
| P2 | Tift | Gemüse | - | - | N |
| P3 | Tift | Gemüse | - | - | N |
| P4 | Tift | Gemüse | + | + | N |
| P5 | Tift | Gemüse | - | - | N |
| P6 | Tift | Gemüse | - | + | N |
| P7 | Tift | Gemüse | - | - | N |
Tabelle 1: Nachweis von Bewässerungswasser aus Dem südlichen GA.
| Primer-Typ | Primername | Sequenz 5'-3' | Quelle | ||
| Lampe | PCA3-F3 | TGTGTGTGTTCGATCACA | Diese Studie | ||
| PCA3-B3 | TTTTTGCGTGCGTCCAGA | Diese Studie | |||
| PCA3-FIP | GACACCAAGCACTCGTACTOGTTTTTACAATTGTGCAGAGGGAGGA | Diese Studie | |||
| PCA3-BIP | AGAACGAGTATTCGGCGGCGTTTTGAAAAGGACCCCCG | Diese Studie | |||
| PCA3-LF | TGTCGAATGGATTTGCGATCTT | Diese Studie | |||
| PCA3-LB | ATACGCAGGTCATTTGACTGAC | Diese Studie | |||
| Pcr | PC-1 | GTCTTGTACCCTATCATGGCG | Zhang et al., 2006 | ||
| PC-2 | CGCCACAGCAGGAAAAGCATT | Zhang et al., 2006 | |||
Tabelle 2: In dieser Studie verwendete Primer.
| Parameter | traditionell | Konventionelle PCR | Lampe |
| Empfindlichkeit | Na | 4.8 X 102 Sporen/ml | 1.2 X 102 Sporen/ml |
| Zeit | 2 Wochen oder länger | 2-3 Stunden (ohne DNA-Extraktion) | 30 Min. - 1 Stunde (ohne DNA-Extraktion) |
| Vorbereitung | • Medienerstellung • Beschichtung und Isolierung und • Entwerfen einer Falle |
• Sporensammlung mit Filterpapier • DNA-Extraktion und • PCR-Assay |
• Sporensammlung mit Filterpapier • DNA-Extraktion und • LAMP-Test |
| Materialien | • Autoklav • Medien und Platten • Inkubationsraum • Durchflusshaube • Auberginen • Milchkiste |
• Thermischer Cycler • Agar Gel • Gel Doc |
• Wärmeblock oder • Genie III |
| Kosten | 5,00 USD pro Falle | 0,60 USD pro Reaktion | 0,75 USD pro Reaktion |
Tabelle 3: Vergleich der Methoden zum Nachweis von P. capsici.
Ergänzende Abbildung 1: Lage von Tift County, GA und Proben von Bewässerungswasser, das von verschiedenen Standorten aus dem Bundesstaat entnommen wurde. Positive Proben wurden als rote Punkte angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 2: Design des LAMP-Grundierungssets. Pfeile zeigen die Richtung an, wie Primer gelesen werden. Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.
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Discussion
Die Prüfung von Bewässerungswasser auf Phytopathogene ist ein entscheidender Schritt für Züchter, die Bewässerungsteiche und recyceltes Wasser verwenden27. Bewässerungsteiche bieten ein Reservoir und Brutplatz für eine Reihe von Phytopathogenen, da überschüssiges Bewässerungswasser vom Feld zum Teich geleitet wird, der alle Krankheitserreger mit sich führt, die möglicherweise vorhanden waren16,27. Die traditionelle Methode zum Nachweis von Pflanzenpathogenen in einer großen Wasserquelle besteht darin, einen Köder für den Erreger zu setzen, indem empfängliches Wirtsgewebe (z. B. Früchte, Blätter) verwendet werden, das im Teich ausgesetzt ist, und auf eine Infektion zu warten, dann die Früchte/Blätter zu entfernen und die Diagnose mit Mikroskopie oder molekularen Methoden13,14zu bestätigen. Diese Methoden beschränken sich aufgrund der Zeit, die für die Ausführung des Erkennungstests erforderlich ist (2 Wochen oder länger), und der erforderlichen Arbeits- und Ausrüstungsanforderungen. Darüber hinaus sind umfangreiche Erfahrungen und Kenntnisse in der visuellen Diagnostik, Pathogenmorphologie und Taxonomie für genaue Ergebnisse erforderlich. Molekulare Techniken wie PCR, qPCR und DNA-Hybridisierung benötigen deutlich weniger Zeit (3-4 h) als die herkömmlichen Nachweismethoden; Sie benötigen jedoch teure Ausrüstung und eine Laborumgebung. Darüber hinaus erlauben diese Techniken keine Verarbeitung großer Wassermengen. Auch serologische Assays bleiben aufgrund nicht zielpositiver Reaktionen in ihrer Nachweisfähigkeit zurück, und es wurden keine artspezifischen Assays für Phytophthora-Arten entwickelt. Loop-vermittelte isotherme Amplifikation (LAMP) wurde vor kurzem als Vor-Ort-Diagnosetechnik für den schnellen und empfindlichen Nachweis mehrerer Krankheitserreger eingesetzt, da der Test nur eine einzige Temperatur anstelle eines thermischen Cyclers28,29erfordert. LAMP kann im Feld mit einem farbmetrischen Farbstoff zur visuellen Bestätigung oder mit einer Echtzeit-Verstärkungsmaschine für Ergebnisse in weniger als einer Stunde30ausgeführt werden.
Das Ziel dieses Experiments war es, eine schnelle und empfindliche Methode zu entwickeln, um das Vorhandensein von Phytophthora capsici in Wasserquellen entweder vor Ort oder in einem Labor zu erkennen. Um die Erkennungsgeschwindigkeit zu erhöhen und die Grenzen der oben genannten Methoden zum Nachweis von P. capsici im Bewässerungswasser zu bekämpfen, haben wir eine Methode mit Filterpapier entwickelt, um die Sporen zu erfassen und ihre DNA aus einem größeren Wasservolumen zu extrahieren. Nachdem Sporen mit der Filterpapiertechnik eingefangen und DNA extrahiert wurde, wurde das Vorhandensein des Erregers auf der Grundlage eines neu entwickelten LAMP-Primers bestätigt, der speziell für P. capsicibestimmt ist. Die Erkennungsempfindlichkeit und Spezifität wurde mit LAMP und PCR verglichen. In allen 3 Replikationen und mit allen Zoosporenkonzentrationen war LAMP eine schnellere und empfindlichere Detektionsmethode (Tabelle 3). Diese Methode wird nicht durch ein kleines Probenvolumen als herkömmliche Methoden eingeschränkt, da diese Methode bis zu 1 L Wasser gleichzeitig getestet werden kann, was die Wahrscheinlichkeit des Nachweises von Krankheitserregern erhöht. Bei tests wurde festgestellt, dass das langsame Gießen von Bewässerungswasser durch den Buchner-Trichter mit einer Geschwindigkeit von nicht mehr als 40 ml pro Sekunde die Sporenerfassungsfähigkeit des Filterpapiers erhöhte.
Zur Validierung des Nachweisprotokolls wurden auch Wasserproben aus dem Gebiet entnommen, in dem P. capsici vermutet wurde (Ergänzende Abbildung 1), um die entwickelte Methode mit einem praktischen Szenario zu testen. Von den 7 getesteten Farmen waren 3 positiv für das Vorhandensein von P. capsici mit dem LAMP-Assay (Abbildung 6A-6C), während nur eine Farm positiv war, wenn der herkömmliche PCR-Assay verwendet wurde (Abbildung 6D), der LAMP als empfindlicheren Test für diese Methode zur Prüfung von Bewässerungswasser zeigte. Obwohl dieser filterbasierte LAMP-Assay DNA aus einer Konzentration von nur 1,2 x 102 Zoosporen/ml detektieren konnte, die deutlich geringer war als die ursprüngliche Empfindlichkeit dieses Tests (0,01 ng genomische DNA, die 5 Sporen entspricht) mit ungefilterter Zoosporensuspension. Der vorherige LAMP-Assay von Dong et. al. (2015)20 wurde auf der gleichen seriellen Verdünnung ausgeführt und die Empfindlichkeit war gleich (Abbildung 2F). Der Nachweisgrad für einen PCR-Assay mit ungefilterter Sporenlösung hat auch eine höhere Detektionsstufe (äquivalent 10 Sporen) gezeigt, die den vorherigen PCR-basierten Befunden10sehr ähnlich war. Die Sporenerkennungsgrenze der traditionellen Ködermethode der Detektion wurde nicht überprüft, da eine einzelne Sporen je nach ihrer individuellen Fähigkeit eine Infektion verursachen könnte. Die verringerte Empfindlichkeit, die sowohl in LAMP- als auch in PCR-Assays gefunden wird, ist wahrscheinlich darauf zurückzuführen, dass einige Sporen durch oder um das Filterpapier fließen oder einmal am Filterpapier befestigt sind und nicht mit 100% Effizienz extrahiert werden können. Dennoch kann dieses neue LAMP- und Filtersystem ein viel höheres Wasservolumen verarbeiten und analysieren als bisherige Methoden und verleiht eine höhere Spezifität und Geschwindigkeit für die In-Feld-Erkennung.
Von den verwendeten Extraktionsmethoden war die magnetische Perlenextraktion die schnellste und erforderte nicht den Einsatz externer Maschinen wie einen Perlenschlag oder eine Zentrifuge, was sie für die Extraktion im Feld nützlich macht und die tragbare Funktion des LAMP-Assays ergänzt. Die CTAB-basierte Methode lieferte die höchste DNA-Konzentration, dauerte aber die längste Zeit, während das kommerzielle DNA-Extraktionskit für Pflanzen (z. B. DNeasy) sowohl in der benötigten Zeit als auch in der erworbenen DNA-Konzentration an zweiter Stelle stand.
Sowohl bei CTAB als auch beim kommerziellen Pflanzen-DNA-Extraktionskit wurde bei der Homogenisierung von Filterpapier festgestellt, dass die Homogenisierung erfolgreicher war und eine höhere Konzentration ergab, wenn die CTAB-Lösung (oder Extraktionspuffer) mit den Stücken Filterpapier in das Rohr aufgenommen wurde, bevor mit dem Perlenschlagen oder der Handhomogenisierung begonnen wurde. Das Schlagen von Perlen erfolgte 3 Mal für jeweils eine Minute, aber das Wirbeln und Agitieren des Rohres zwischen jeder Runde war für eine vollständige Homogenisierung in allen Extraktionsmethoden notwendig. Wichtig ist, dass das Filterpapier an den Seiten oder am Boden des Rohres stecken bleibt, daher ist es wichtig, sicherzustellen, dass das Filterpapier von den Wänden entfernt ist, damit es homogenisiert wird.
Die Gesamtzeit für die Verstärkung beträgt 90-120 min und kann im Feld für die Vor-Ort-Diagnose problemlos durchgeführt werden. Diese Filtermethode wurde auch entwickelt, um erhebliche Wassermengen zu filtern, um die möglichen Chancen für den Nachweis des Erregers zu erhöhen. Diese Methode ist auch auf viele Krankheitserreger anwendbar, die in einer Wasserquelle ansammeln können, insbesondere Gattungen wie: Pythium, Phytophthora, Fusariumund Bakterien; Die einzige Änderung, die erforderlich ist, ist die Entwicklung eines ebenso spezifischen LAMP-Primers für den gezielten Erreger30.
Ein wesentlicher Output dieser Arbeit ist die Entwicklung eines hochsensiblen und schnellen Filterpapier-basierten LAMP-Assays zum Nachweis von P. capsici in Bewässerungswasserquellen. Wir gehen davon aus, dass diese Studie zu einer Sensibilisierung für die Kontamination von recyceltem Bewässerungswasser führen und schließlich das Management von Phytophthora-assoziierten Krankheiten verbessern und folglich die Produktionskosten senken und den Ernteertrag erhöhen wird. Solche Informationen sind dringend erforderlich, um die Nachhaltigkeit der Gemüseproduktion zu verbessern und die Rentabilität der Gemüseproduktion zu steigern.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten oder Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Diese Arbeit erhielt die finanzielle Unterstützung der Georgia Commodity Commission for Vegetables Projekt ID- FP00016659. Die Autoren danken Dr. Pingsheng Ji, University of Georgia und Dr. Anne Dorrance, Ohio State University für die Bereitstellung reiner Kulturen von Phytophthora spp. Wir danken auch Li Wang und Deloris Veney für ihre technische Unterstützung während der gesamten Studie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose gel powder | Thomas Scientific | C997J85 | |
| Buchner funnel | Southern Labware | JBF003 | |
| Bullet Blender | Next Advance | BBX24 | |
| Centrifuge 5430 | Eppendorf | 22620509 | |
| Chloroform | Fischer Scientific | C298-500 | |
| CTAB solution | Biosciences | 786-565 | |
| Dneasy Extraction Kit | Qiagen | 69104 | |
| Filter Flask | United | FHFL1000 | |
| Filter Paper | United Scientific Supplies | FPR009 | |
| Gel Green 10000X | Thomas Scientific | B003B68 (1/EA) | |
| Genie III | OptiGene | ||
| Hand pump | Thomas Scientific | 1163B06 | |
| Iso-amyl Alcohol | Fischer Scientific | BP1150-500 | |
| LAVA LAMP master mix | Lucigen | 30086-1 | |
| Magnetic bead DNA extraction | Genesig | genesigEASY-EK | |
| Magnetic Separator | Genesig | genesigEASY-MR | |
| polyvinylpyrrolidone | Sigma Aldrich | PVP40-500G | |
| Primers | Sigma Aldrich | ||
| Prism Mini Centrifuge | Labnet | C1801 | |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | |
| UV Gel Doc | Analytik Jena | 849-00502-2 | |
| Warmstart Colorimetric Dye | Lucigen | E1800m | |
| Wide Mini ReadySub-Cell GT Cell | Bio-Rad | 1704489EDU | |
| 70% isopropanol | Fischer Scientific | A451-1 |
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