슈완 세포 표현형 사양을 평가하기 위한 튜블드 세포 외 세포 매트릭스 미세 환경의 준비
Summary
이 방법론은 기판 강성, 단백질 조성 및 세포 형태와 같은 세포 외 매트릭스 큐가 슈완 세포 (SC) 표현형을 조절하는 메커니즘을 설명하는 것을 목표로합니다.
Abstract
외상성 말초 신경계 (PNS) 부상은 현재 완전한 기능 적 회복을 회복하기위해 적절한 치료가 부족합니다. 슈완 세포 (SCs), PNS의 주요 신경교 세포로, 부상 다음 재생 세포 표현형으로 분화하여 PNS 재생을 촉진에 중요한 역할을한다. 그러나, SC의 차별화된 상태는 재생에 필요한 기간을 통해 유지하기 가 어렵고 주변 세포외 매트릭스(ECM)의 변화에 의해 영향을 받고 있다. 따라서 SC와 ECM 간의 복잡한 상호 작용을 결정하여 SC의 재생 잠재력에 대한 단서를 제공하는 것이 필수적입니다. 이를 해결하기 위해, 다른 ECM 단백질이 강성과 단백질 조성물을 조절할 수 있는 플랫폼을 제공하는 튜닝 가능한 폴리디메틸실록산(PDMS) 기판에 흡착된 전략이 만들어졌습니다. SC는 SC 표현형의 역학을 나타내는 튜닝 가능한 기판 및 중요한 세포 기능에 시드되었다. SC 단백질 발현과 세포 형태 사이의 상호 작용을 설명하기 위해 개별 마이크로접촉 인쇄 세포 패턴 이외에 SC의 다른 종자 밀도가 면역 형광 염색 및 서부 얼룩을 특징으로하고 활용되었습니다. 결과는 더 작은 퍼설리고 세포 신장의 더 높은 넓이를 가진 세포가 SC 재생 현상관 마커의 상부를 승진시켰다는 것을 보여주었습니다. 이 방법론은 SC의 ECM과 세포 기능 사이의 중요한 관계를 해명하기 시작할뿐만 아니라 말초 신경 수리에서 생체 재료의 미래 최적화에 대한 지침을 제공합니다.
Introduction
말초 신경계(PNS) 부상은 환자의 삶의 질을 손상시키고 다양한 사회경제적 인자를 통해 상당한 영향을 미치게 함으로써 헬스케어의 주요 임상과제로남아 있다1,2. Schwann 세포 (SC), PNS에 있는 주요 신경교 세포로, PNS 재생을 유도하고 짧은 간격 상해에 있는 기능적인 복구에 있는 원조에 필요한 분자 및 물리적 단서를 제공합니다. 이는 SC가 골수성 또는 Remak 표현형3으로부터“수리” 세포 표현형으로 분화하는 놀라운 능력 때문입니다. 수리 SC는 여러 가지 면에서 독특한 세포 표현형입니다. 부상 후, SC는 세포 주기를 다시 입력하여 증식 속도를 증가시키고 재인교정을 용이하게하기 위해 여러 전사 적 요인의 발현을 시작합니다. c-Jun 및 p75 NTR과 같은 이러한 요인은 미엘린 기본 단백질(MBP)과 같은 골수화 SC 마커를 증가시키는 동안4,,5로조절된다. 또한, SC는 형태학을 변경하여 길어지고 서로 정렬하여 부상 부위6을가로질러 Büngner 밴드를 형성한다. 이것은 축축이 올바른 탈모 표적7로확장하기 위한 물리적 지도 메커니즘을 제공한다. 그러나, SC가 짧은 간격 부상에서 신경 재생을 촉진하기 위하여 소유하는 능력에도 불구하고, 기능적인 회복의 결과는 가혹한 상해에 있는 가난한 남아 있습니다. 이는 세포외 매트릭스(ECM) 유도 단서의 손실뿐만 아니라 오랜 기간 동안 재생 형형을 유지하기 위한 SC의무능력8에기인한다.
신경 재생 및 회복 과정은 부상 후 기저 라미나 상태에 밀접하게 묶여 있습니다. 기저 라미나는 지도를 용이하게하고 부상 후 그대로 남아있는 경우 축축및 SC에 대한 ECM 바인딩 큐를 제공하는 신경 주위ECM의층입니다 9. ECM의 상태와 세포에 행렬 바운드 큐를 전달하는 능력은 매우 중요하며 이전에는 다양한컨텍스트(10,,11,,12,,13,,14)에서탐구되었다. 예를 들어, ECM의 강성은 증식 및 분화(11,,15,,16)와같은 세포 기능을 유도할 수 있는 것으로 나타났다.15 ECM의 조성물은 또한 세포내 신호 전달 경로를 통해 이동 및 분화와 같은 세포 행동을 뚜렷한 세포 반응으로 이끌어 내고17,,18을조절할 수 있다. 더욱이, 세포 형태학은, 확산 영역 및 세포 신장을 포함하여, 기능을 조절하는 데 중요한 역할을 하며, ECM-바운드큐(19,,20)에의해 지배될 수 있다. 많은 이전 연구는 정의된 혈통으로 분화하는 줄기 세포에 초점을 맞추었지만, SC는 신경 부상5,,21에따라 ECM을 리모델링하면서 단백질과 성장 인자를 분비할 수 있는 수리 SC로, 건강한 신경 내에서 숙성, 성인 SC로부터 표현형을 변경하는 유사한 능력을 가지고 있다. 따라서, 본질적으로 신경 재생을 위한 이 용량을 이용하기 위하여 통찰력에 대한 선천적인 SC 재생 능력 과 ECM 바운드 단서 사이 관계의 근본적인 기계장치를 확인하는 것이 특히 중요합니다.
이를 해결하기 위해, 우리는 기계적 강성과 리간드 유형이 생리학적으로 관련된 범위에서 쉽게 조정할 수있는 세포 배양 기판을 생산하는 상세한 방법론을 개발했습니다. 폴리디메틸 실록산(PDMS)은 폴리아크릴아미드 젤과 비교하여 고도의 튜닝 역학으로 인해 기판으로 선택되었으며, 최대 영의 계수는 약 1000kPa22,,23,,24에서PDMS와 대조된다. 이것은 손에 작업에 도움이, 최근 연구는 토끼 sciatic 신경의 영의 계수를 초과 할 수 있음을 보여 주었다으로 50 kPa 개발 하는 동안, 따라서 PNS 내신경의 강성의 범위가 이전에 검사 보다 넓은 제안. 상이한 단백질은 SC 행동에 역학 및 리간드의 조합 조절을 분석하기 위해 PDMS 기판에 흡착할 수 있습니다. 이를 통해 PNS 재생 공정에 존재하는 다중 미세환경 적 단서를 조사하고기판(25)의강성에만 초점을 맞춘 작업과 높은 수준의 튜닝성을 비교할 수 있다. 또한, 이러한 엔지니어링 된 세포 배양 기판은 면역 조직 화학, 서부 블롯 및 정량 중합효소 연쇄 반응 (q-PCR)과 같은 다양한 정량 적 분석 방법과 호환됩니다.
이 엔지니어링 된 세포 배양 플랫폼은 각 ECM 바인딩 신호의 높은 수준의 개별 튜닝성으로 인해 기계화 경로를 분석하는 데 매우 적합합니다. 또한, 마이크로접촉 인쇄를 포함한 세포 마이크로패싱에 대한 인기 있는 방법은 다른 ECM 바운드큐(24)와관련하여 세포 형상을 분석하기 위해 조절된 세포 접착을 허용하기 위해 기판상에서 달성될 수 있다. 이는 세포 집단의 신장을 촉진하는 선 패턴 기판이 신경 재생 중에 Büngner 대역 내에서 길쭉한 재생 식 SC를 모방하고 연구하는 도구를 제공하기 때문에 매우 중요합니다. 또한, 세포 형태는 다중 세포 기능의 강력한 레귤레이터이며,26,,27을제어하지 않으면 잠재적으로 혼란스러운 실험 결과를 도입할 수 있다. 현재 ECM cues28,,29,,30에의해 조절되는 SC 재생 표현형을 지배하는 메커니즘에 상당한 주의가 제공되고 있다. 이것은 PNS 신경 재생에 있는 원조를 위한 신경 지도 도관으로 적용될 수 있는 생물 물질의 디자인에 통찰력을 제공하기 위하여 필수적입니다. 이러한 상세한 프로토콜은 궁극적으로 ECM 바운드 큐에 의해 조절되는 SC 및 기타 세포 유형 함수의 메커니즘을 해독하는 잠재적 인 도구로 적용 될 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
SC는 신경 손상 에 따라 그들의 표현성 변환 및 재생 잠재력으로 인해 신경 재생을 촉진할 수 있습니다. 그러나, ECM 큐가 이 재생 능력을 통제하는 방법은 신경 재생을 승진시키는 것을 목표로 하는 생체 재료의 발달뿐 아니라 신경 재생에 관련되었던 기계장치의 이해를 잠재적으로 방해하는, 주로 불분명남아 있습니다. 이러한 상호 작용을 조사하기 시작하기 위해, 세포 배양 기질은 강성, 단백질 …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 감사 신시내티 대학의 자금 지원을 인정합니다. 저자는 또한 지원을 신시내티 대학 고급 재료 특성화 연구소의 론 Flenniken 감사.
Materials
| Albumin from Bovine Serum (BSA), Texas Red conjugate | Thermo Fisher Scientific | A23017 | BSA staining to show micropatterns |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7076S | Antibody used for western blot analysis |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7074S | Antibody used for western blot analysis |
| BrdU | Thermo Fisher Scientific | B23151 | Reagent used to measure cell proliferation |
| BrdU primary antibody conjugated with Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | B35130 | Used to visualize BrdU in cell proliferation assays |
| Collagen I | Thermo Fisher Scientific | A10483-01 | Protein used to coat coverslips |
| Compression force test machine | TestResources | Instrument to quantify mechanical properties of polymers | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | Cell culture medium |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | Cell culture medium supplemental |
| Fibronectin | Thermo Fisher Scientific | 33010-018 | Protein used to coat coverslips |
| Fluorescence microscope | Nikon | Eclipse Ti2 | Fluorescence microscope |
| Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) | Thermo Fisher Scientific | 78440 | Protease and Phosphatase Inhibitor |
| Laminin | Thermo Fisher Scientific | 23017015 | Protein used to coat coverslips |
| Mounting medium with DAPI | Thermo Fisher Scientific | P36971 | Coverslip mountant and nuclei staining |
| Mouse c-Jun primary antibody | Thermo Fisher Scientific | 711202 | Primary antibody to visualize c-Jun protein |
| Mouse β-Actin primary antibody | Cell Signaling Technology | 3700S | Loading control for western blot experiments |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Cell culture medium supplemental |
| Photoresist SU 2010 | KAYAKU | SU8-2010 | Photoresist |
| Pluronic F-127 | Sigma Aldrich | P-2443 | Block non-specific protein binding |
| Rabbit c-Jun primary antibody | Cell Signaling Technology | 9165S | Primary antibody for visualization of c-Jun protein |
| Rabbit myelin basic protein primary antibody | Abcam | ab40390 | Primary antibody for visualization of MBP |
| Rabbit p75NTR primary antibody | Cell Signaling Technology | 8238S | Primary antibody for visualization of p75NTR |
| Rhodamine phalloidin | Thermo Fisher Scientific | R415 | Visualization of cell cytoskeleton |
| RIPA buffer | Abcam | ab156034 | Cell lysis buffer |
| RT4-D6P2T Schwann cell line | ATCC | CRL-2768 | Cell line used in experiments |
| SYLGARD 184 PDMS base and curing agent | Sigma Aldrich | 761036 | Tunable polymer used to coat coverslips |
| Trypsin | Thermo Fisher Scientific | 15090-046 | Cell dissociation reagent |
| UV-Ozone cleaner | Novascan | Increase hydrophicility of PDMS | |
| Versene (1x) | Thermo Fisher Scientific | 15040066 | Cell dissociation reagent |
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