Summary

הכנת למימדי מיקרותאי מטריצה מטריצות להערכת Schwann מפרט Cell

Published: June 02, 2020
doi:

Summary

מתודולוגיה זו שואפת להמחיש את המנגנונים שבהם מדובר ברמזים של מטריקס כגון קשיות המצע, הרכב החלבון ומורפולוגיה התא ויסות התא Schwann (SC) פנוטיפים.

Abstract

מערכת העצבים ההיקפית טראומטית (היקפית) פציעות כרגע חסר טיפולים מתאימים כדי להחזיר התאוששות תפקודית מלאה. תאים schwann (ה scs), כמו התאים העיקריים גליה של היקפית, לשחק תפקיד חיוני בקידום התחדשות היקפית על ידי הבחנה לתוך תא התחדשות פניטיפ לאחר הפציעה. עם זאת, המצב הה scs של המדינה מאתגרת לשמור דרך תקופת הזמן הדרושה להתחדשות והיא מושפע משינויים במטריצה שמסביב (ECM). לכן, קביעת הגומלין המורכבים בין ה scs לבין ECM שונות כדי לספק רמזים של פוטנציאל משובי של ה scs הוא חיוני. כדי להתייחס לכך, אסטרטגיה נוצרה כאשר חלבונים ecm שונים היו נספחת על המצע polydiמתיל siloxane (pdms) אשר סיפק פלטפורמה שבה נוקשות והרכב חלבון יכול להיות מאופנן. ה scs היו הנזרע על מצעים התאים הקריטיים פונקציות הסלולר המייצגים את הדינמיקה של SC פנוטיפים נמדדו. כדי להמחיש את הגומלין בין ביטוי חלבון SC לבין מורפולוגיה הסלולר, שונים צפיפות הזריעה של ה scs בנוסף מיקרומגע בודדים מודפס דפוסים סלולריים היו מנוצלים ומאופיין על ידי immunofluorescence כתמי והאבן המערבית אבן. תוצאות הראו כי תאים עם שטח התפשטות קטן יותר ובהיקף גבוה יותר של התארכות הסלולר לקדם רמות גבוהות יותר של סמנים משובי התחדשות של SC. מתודולוגיה זו לא רק מתחילה לפענח את הקשר המשמעותי בין הפונקציה ECM והסלולר של ה scs, אבל גם מספק הנחיות לאופטימיזציה עתידית של ביואטילים בתיקון עצבי היקפי.

Introduction

מערכת העצבים ההיקפית (היקפית) פציעות להישאר אתגר קליני גדול בטיפול רפואי על ידי התפשרות על איכות החיים עבור חולים ויצירת השפעה משמעותית באמצעות המון גורמים סוציואקונומיים1,2. התאים schwann (SC), כמו תאים גליה העיקריים ב היקפית, לספק רמזים מולקולריים הדרושים כדי לגרום התחדשות היקפית וסיוע שחזורים תפקודית בפציעות פער קצר. זה בגלל היכולת המדהימה של ה scs להפריד לתוך “תיקון” תא מושגים מתוך מיאלואידית או מיפוי פניטיפ3. התיקון SC הוא התאים הייחודיים הפנוטיפ במספר דרכים. לאחר הפציעה, ה scs להגדיל את שיעור ההתפשטות שלהם על ידי הזנה מחדש של מחזור התא ולהתחיל ביטוי של מספר גורמים משתנים כדי להקל על שימור. גורמים אלה, כגון c-Jun ו p75 ntr, הם upregulated בעוד סמנים מיאלווניים, כמו חלבון מיאלין בסיסי (mbp), הם מוסדרות4,5. בנוסף, ה scs שינוי מורפולוגיה להיות מוארך ומיושר אחד עם השני כדי ליצור להקות Büngner על פני הפגיעה באתר6. הדבר מספק מנגנון הנחיה פיזי עבור האקסונים כדי להאריך את המטרה הנכונה7. עם זאת, למרות היכולת כי ה scs יש לקדם התחדשות העצב בפציעות פער קצר, התוצאה של התאוששות תפקודית נשאר עני בפציעות חמורות. זה נובע בחלקו לאובדן של מטריקס מטריצה (ECM) רמזים הדרכה, כמו גם את חוסר היכולת של ה scs לשמור על פניטיפים משובי על פרקי זמן ארוכים של זמן8.

התחדשות העצב ותהליך ההחלמה קשורים באופן אינטימי למצב של לינה הבסיס לאחר הפציעה. טרף הבסיס היא שכבה של ecm סביב העצב המקל הדרכה ומספק הרמזים ecm מאוגד עבור אקסונים ו ה scs במקרים שבהם הוא נשאר שלם לאחר הפציעה9. מצב ה-ecm והיכולת שלה לספק רמזים מאוגדים במטריקס לתאים הוא חיוני ובעבר בחנו במגוון הקשרים שונים10,11,12,13,14. לדוגמה, זה הוכח כי הנוקשות של ecm יכול להנחות פונקציות תא כגון התפשטות ובידול11,15,16. הרכב של ecm יכול גם להוביל לתגובה סלולרית ברורה לווסת התנהגויות תא כגון הגירה בידול באמצעות מסלולים מאותת תאיים17,18. יתר על כן, מורפולוגיה התא, כולל שטח התפשטות והתארכות הסלולר, לשחק תפקיד מרכזי בוויסות הפונקציה והוא יכול להיות נשלט על ידי הרמזים ecm19מאוגד 19,20. מחקרים קודמים רבים התמקדו בתאי גזע המבדילים לתוך ליננים מוגדרים, עדיין ה scs בעלי יכולת דומה לשנות פנוטיפ מן הומסטטי, מבוגר SC בתוך עצב בריא, כדי תיקון SC מסוגל הפרשה חלבונים וגורמי גדילה תוך שיפוץ של ecm פציעה העצבים הבאה5,21. לכן, זה חיוני במיוחד כדי לזהות מנגנונים הנמצאים בבסיס היחסים בין הקיבולת הטבועה של משובי SC ו ECM מאוגד רמזים עבור התובנה בסופו של דבר לרתום את היכולת הזו להתחדשות העצב.

כדי לענות על כך, פיתחנו מתודולוגיה מפורטת כדי לייצר מצע של תרבות התא שבו נוקשות מכנית, ליגנד סוג ניתן לכוונן בקלות בטווחים הרלוונטיים פיזיולוגית. Polydimethyl תיל siloxane (pdms) נבחרה כמצע בשל המכניקה שלה מאוד מאוד מאוד משלה לעומת polyאקרילאמיד ג’ל, שם מודולוס הצעיר המרבי הוא סביב 12 kpa בניגוד pdms בסביבות 1000 kpa22,23,24. זה מועיל לעבודה בהישג יד, כפי שמחקרים שנעשו לאחרונה הראו את מודולוס של הצעיר של עצב הארנב יכול לעלות על 50 kPa במהלך הפיתוח, ובכך מציע כי טווח הנוקשות של העצבים בתוך היקפית הוא רחב יותר מאשר נבדק בעבר. חלבונים שונים מסוגלים ספיחה על מצעים pdms לנתח את הרגולציה קומבינטורית של מכניקה וליגטים על התנהגות SC. זה מאפשר את החקירה של מספר רמזים מיקרו סביבתיים בתהליך התחדשות היקפית והשוואה של רמה גבוהה של היכולת לעבוד התמקדות אך ורק על נוקשות של מצע25. יתר על כן, אלה מהונדסים התרבות תאים מצעים תואמים עם ריבוי של שיטות ניתוח כמותי כגון אימונוהיסטוכימיה, כתם מערבי, ואת תגובת שרשרת פולימראז כמותי (q-PCR).

פלטפורמה זו של תרבות התא מהונדסים מתאים מאוד לניתוח מסלולים מכניסטיים עקב רמה גבוהה של מנהרה בודדים של כל אות ECM מאוגד. בנוסף לכך, ניתן להשיג שיטות נפוצות למיקרו-תאים, כולל הדפסת מיקרו-מגעים, על מנת לאפשר הדבקה תאית מבוקרת כדי לנתח את צורת התא ביחס לרמזים אחרים המאוגדים ב-ECM24. זה קריטי כי קו מצעים השורה, אשר לקדם התארכות באוכלוסיות תאים, לספק כלי לחקות וללמוד מוארך ומשובי ה scs בתוך להקות Büngner במהלך התחדשות העצב. יתרה מזאת, מורפולוגיה סלולרית היא מווסת חזק של פונקציות תא מרובות והוא עלול להחדיר תוצאות נסיוניות אם לא נשלט26,27. תשומת לב משמעותית מסופק כעת למנגנון המסדירים את משובי SC פנוטיפ מוסדר על ידי המקלות ecm28,29,30. זה חיוני כדי לספק תובנה לתוך העיצוב של ביואטילים כי ניתן להחיל כתעלות הדרכה עצבים לסיוע התחדשות העצב היקפית. אלה פרוטוקולים מפורטים יכול בסופו של דבר להיות מיושם ככלי פוטנציאלי כדי לפענח את המנגנונים של SC ותפקוד סוג תא אחר כפי מוסדר על ידי רמזים מאוגדים ECM.

Protocol

1. הכנה ואפיון של תרבות תא מטונתן הכנת מצע מערבבים את בסיס האלסטומר של PDMS ומאשפדים את הסוכנים באמצעות טיפ פיפטה במרץ ביחס בין 10:1 ל-60:1 עד שבועות הינם מפוזרים באופן הומוגנטי בתוך התערובת. להסיר בועות באמצעות התייבשות ואקום עד מתפוגג בועות.הערה: במהלך PDMS פולימור, ריפוי הס…

Representative Results

כדי לנתח ולכמת את הגומלין בין קשיות המצע ואת הרכב החלבון ב-SC פניטיפ, המצע לתרבות תא PDMS של מנהרה פותחה (איור 1A). בדיקות דחיסה של פולימר בבסיס שונה: ריפוי יחסי הסוכן היה מנוצל לכמת את המודולריות של צעירים (E) של המצע (איור 1B). הטווח המתקבל של ערכי מודולוס מייצג תנא?…

Discussion

ה scs יכול לקדם התחדשות העצב בשל הטרנספורמציה פנוטימית שלהם פוטנציאל התחדשות לאחר פגיעה בעצב. עם זאת, איך הרמזים ECM לווסת את יכולת ההתחדשות הזו נותרת בלתי ברורה ברובו, באופן פוטנציאלי לא רק את ההתפתחות של ביואטילים כי המטרה לקדם התחדשות עצבים, אלא גם את ההבנה של המנגנונים המעורבים התחדשות הע…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחברים מודים בהכרת התמיכה מאוניברסיטת סינסינטי. המחברים גם מודים לרון פלמוזיקן מתוך המעבדה לאפיון חומרים מתקדמים של אוניברסיטת סינסינטי לצורך תמיכה.

Materials

Albumin from Bovine Serum (BSA), Texas Red conjugate Thermo Fisher Scientific A23017 BSA staining to show micropatterns
Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody Cell Signaling Technology 7076S Antibody used for western blot analysis
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody Cell Signaling Technology 7074S Antibody used for western blot analysis
BrdU Thermo Fisher Scientific B23151 Reagent used to measure cell proliferation
BrdU primary antibody conjugated with Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific B35130 Used to visualize BrdU in cell proliferation assays
Collagen I Thermo Fisher Scientific A10483-01 Protein used to coat coverslips
Compression force test machine TestResources Instrument to quantify mechanical properties of polymers
Dulbecco's Modified Eagle Medium Thermo Fisher Scientific 11965092 Cell culture medium
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific 16000044 Cell culture medium supplemental
Fibronectin Thermo Fisher Scientific 33010-018 Protein used to coat coverslips
Fluorescence microscope Nikon Eclipse Ti2 Fluorescence microscope
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) Thermo Fisher Scientific 78440 Protease and Phosphatase Inhibitor
Laminin Thermo Fisher Scientific 23017015 Protein used to coat coverslips
Mounting medium with DAPI Thermo Fisher Scientific P36971 Coverslip mountant and nuclei staining
Mouse c-Jun primary antibody Thermo Fisher Scientific 711202 Primary antibody to visualize c-Jun protein
Mouse β-Actin primary antibody Cell Signaling Technology 3700S Loading control for western blot experiments
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122 Cell culture medium supplemental
Photoresist SU 2010 KAYAKU SU8-2010 Photoresist
Pluronic F-127 Sigma Aldrich P-2443 Block non-specific protein binding
Rabbit c-Jun primary antibody Cell Signaling Technology 9165S Primary antibody for visualization of c-Jun protein
Rabbit myelin basic protein primary antibody Abcam ab40390 Primary antibody for visualization of MBP
Rabbit p75NTR primary antibody Cell Signaling Technology 8238S Primary antibody for visualization of p75NTR
Rhodamine phalloidin Thermo Fisher Scientific R415 Visualization of cell cytoskeleton
RIPA buffer Abcam ab156034 Cell lysis buffer
RT4-D6P2T Schwann cell line ATCC CRL-2768 Cell line used in experiments
SYLGARD 184 PDMS base and curing agent Sigma Aldrich 761036 Tunable polymer used to coat coverslips
Trypsin Thermo Fisher Scientific 15090-046 Cell dissociation reagent
UV-Ozone cleaner Novascan Increase hydrophicility of PDMS
Versene (1x) Thermo Fisher Scientific 15040066 Cell dissociation reagent

References

  1. Taylor, C. A., Braza, D., Rice, J. B., Dillingham, T. The Incidence of Peripheral Nerve Injury in Extremity Trauma. American Journal of Physical Medicine & Rehabilitation. 87, 381-385 (2008).
  2. Noble, J., Munro, C. A., Prasad, V. S. S. V., Midha, R. Analysis of Upper and Lower Extremity Peripheral Nerve Injuries in a Population of Patients with Multiple Injuries. Journal of Trauma and Acute Care Surgery. 45, 116-122 (1998).
  3. Jessen, K. R., Mirsky, R. The repair Schwann cell and its function in regenerating nerves. Journal of Physiology. 594, 3521-3531 (2016).
  4. Arthur-Farraj, P. J., et al. c-Jun Reprograms Schwann Cells of Injured Nerves to Generate a Repair Cell Essential for Regeneration. Neuron. 75, 633-647 (2012).
  5. Jessen, K. R., Mirsky, R. The Success and Failure of the Schwann Cell Response to Nerve Injury. Frontiers in Cell Neurosciences. 13, 33 (2019).
  6. Gomez-Sanchez, J. A., et al. After Nerve Injury, Lineage Tracing Shows That Myelin and Remak Schwann Cells Elongate Extensively and Branch to Form Repair Schwann Cells, Which Shorten Radically on Remyelination. Journal of Neuroscience. 37 (37), 9086-9099 (2017).
  7. Deumens, R., et al. Repairing injured peripheral nerves: Bridging the gap. Progress in Neurobiology. 92, 245-276 (2010).
  8. Höke, A., Gordon, T., Zochodne, D. W., Sulaiman, O. A. R. A decline in glial cell-line-derived neurotrophic factor expression is associated with impaired regeneration after long-term Schwann cell denervation. Experimental Neurology. 173, 77-85 (2002).
  9. Jones, S., Eisenberg, H. M., Jia, X. Advances and future applications of augmented peripheral nerve regeneration. International Journal of Molecular Sciences. 17, 1-17 (2016).
  10. Harris, G. M., et al. Nerve Guidance by a Decellularized Fibroblast Extracellular Matrix. Matrix Biology. 60-61, 176-189 (2017).
  11. Harris, G. M., Piroli, M. E., Jabbarzadeh, E. Deconstructing the Effects of Matrix Elasticity and Geometry in Mesenchymal Stem Cell Lineage Commitment. Advanced Function Mater. 24 (16), 2396-2403 (2014).
  12. Pryzhkova, M. V., Harris, G. M., Ma, S., Jabbarzadeh, E. Patterning pluripotent stem cells at a single cell level. Journal of Biomaterials and Tissue Engineering. 3 (4), 461-471 (2013).
  13. Engler, A. J., Sweeney, H. L., Discher, D. E., Schwarzbauer, J. E. Extracellular matrix elasticity directs stem cell differentiation. Journal of Musculoskeleton and Neuronal Interaction. 7 (4), 335 (2007).
  14. Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. Geometric control of cell life and death. Science. 276 (5317), 1425-1428 (1997).
  15. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix Elasticity Directs Stem Cell Lineage Specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
  16. Pickup, M. W., Mouw, J. K., Weaver, V. M. The extracellular matrix modulates the hallmarks of cancer. EMBO Reports. 15, 1243-1253 (2014).
  17. Chernousov, M. A., Carey, D. J. Schwann cell extracellular matrix molecules and their receptors. Histology and Histopathology. 15, 593-601 (2000).
  18. Shibata, S., et al. Selective Laminin-Directed Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells into Distinct Ocular Lineages. Cell Reports. 25 (6), 1668-1679 (2018).
  19. Mcbeath, R., Pirone, D. M., Nelson, C. M., Bhadriraju, K., Chen, C. S. Cell Shape, Cytoskeletal tenstion and RhoA regulate stem cell lineage committment. Developmental Cell. 6, 483-495 (2004).
  20. Halder, G., Dupont, S., Piccolo, S. Transduction of mechanical and cytoskeletal cues by YAP and TAZ. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13, 591-600 (2012).
  21. Jessen, K. R., Mirsky, R. The repair Schwann cell and its function in regenerating nerves. Journal of Physiology. 594 (13), 3521-3531 (2016).
  22. Lopez-Fagundo, C., Bar-Kochba, E., Livi, L. L., Hoffman-Kim, D., Franck, C. Three-dimensional traction forces of Schwann cells on compliant substrates. Journal of The Royal Society Interface. 11, 20140247 (2014).
  23. Gu, Y., et al. The influence of substrate stiffness on the behavior and functions of Schwann cells in culture. Biomaterials. 33, 6672-6681 (2012).
  24. Xu, Z. Y., Orkwis, J. A., DeVine, B. M., Harris, G. M. Extracellular matrix cues modulate Schwann cell morphology, proliferation, and protein expression. Journal of Tissue Engineering and Regenerative. , (2019).
  25. Urbanski, M. M., et al. Myelinating glia differentiation is regulated by extracellular matrix elasticity. Scientific Reports. 6, 1-12 (2016).
  26. Sun, Y., et al. Tunable stiffness of graphene oxide/polyacrylamide composite scaffolds regulates cytoskeleton assembly. Chemical Sciences. 9 (31), 6516-6522 (2018).
  27. Hwang, J. H., et al. Extracellular matrix stiffness regulates osteogenic differentiation through MAPK activation. PLoS One. 10, 1-16 (2015).
  28. Ryan, A. J., et al. A Physicochemically Optimized and Neuroconductive Biphasic Nerve Guidance Conduit for Peripheral Nerve Repair. Advanced Healthcare Materials. 6, 1-13 (2017).
  29. Du, J., et al. Prompt peripheral nerve regeneration induced by a hierarchically aligned fibrin nanofiber hydrogel. Acta Biomaterialia. 55, 296-309 (2017).
  30. Huang, L., et al. A compound scaffold with uniform longitudinally oriented guidance cues and a porous sheath promotes peripheral nerve regeneration in vivo. Acta Biomaterialia. 68, 223-236 (2018).
  31. Brower, K., White, A. K., Fordyce, P. M. Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices. Jouranl of Visualized Experiments. (119), e55276 (2017).
  32. Gupta, R., et al. Shear stress alters the expression of myelin-associated glycoprotein (MAG) and myelin basic protein (MBP) in Schwann cells. Journal of Orthopaedic Research : Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 23, 1232-1239 (2005).
  33. Harris, G. M., Shazly, T., Jabbarzadeh, E. Deciphering the combinatorial roles of geometric, mechanical, and adhesion cues in regulation of cell spreading. PLoS One. 8 (11), (2013).
  34. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
  35. Schreck, I., et al. C-Jun localizes to the nucleus independent of its phosphorylation by and interaction with JNK and vice versa promotes nuclear accumulation of JNK. Biochemical and Biophysical Research Communications. 407, 735-740 (2011).
  36. Shen, K., Qi, J., Kam, L. C. Microcontact printing of proteins for cell biology. Journal Visualized Experiments. (22), e1065 (2008).
  37. Treter, J., et al. Washing-resistant surfactant coated surface is able to inhibit pathogenic bacteria adhesion. Applied Surface Science. 303, 147-154 (2014).
  38. Lutz, J. F. Polymerization of oligo(ethylene glycol) (meth)acrylates: Toward new generations of smart biocompatible materials. Journal of Polymer Science Part A: Polymer Chemistry. 46 (11), 3459-3470 (2008).
  39. Marcus, M., et al. Interactions of Neurons with Physical Environments. Advanced Healthcare Materials. 6, (2017).
  40. Pu, J. Golgi polarization in a strong electric field. Journal of Cell Science. 118, 1117-1128 (2005).
  41. Blaker, J. J., et al. Bioactive Silk-Based Nerve Guidance Conduits for Augmenting Peripheral Nerve Repair. Advanced Healthcare Materials. 7, 1800308 (2018).
  42. Daly, W., Yao, L., Zeugolis, D., Windebank, A., Pandit, A. A biomaterials approach to peripheral nerve regeneration : bridging the peripheral nerve gap and enhancing functional recovery. Journal of the Royal Society of Interface. 9 (67), 202-221 (2012).
  43. Xia, H., et al. Directed neurite growth of rat dorsal root ganglion neurons and increased colocalization with Schwann cells on aligned poly(methyl methacrylate) electrospun nanofibers. Brain Research. 1565, 18-27 (2014).
  44. Wang, H. B., Mullins, M. E., Cregg, J. M., McCarthy, C. W., Gilbert, R. J. Varying the diameter of aligned electrospun fibers alters neurite outgrowth and Schwann cell migration. Acta Biomaterialia. 6, 2970-2978 (2010).
  45. Carvalho, C. R., Oliveira, J. M., Reis, R. L. Modern Trends for Peripheral Nerve Repair and Regeneration: Beyond the Hollow Nerve Guidance Conduit. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 337 (2019).
  46. Yang, Y., Wang, K., Gu, X., Leong, K. W. Biophysical Regulation of Cell Behavior – Cross Talk between Substrate Stiffness and Nanotopography. Ingénierie. 3, 36-54 (2017).
  47. Tan, J. L., Liu, W., Nelson, C. M., Raghavan, S., Chen, C. S. Simple Approach to Micropattern Cells on Common Culture Substrates by Tuning Substrate Wettability. Tissue Engineering. 10, 865-872 (2004).
  48. Grove, M., et al. YAP/TAZ initiate and maintain schwann cell myelination. Elife. 6, 1-27 (2017).
  49. Poitelon, Y., et al. YAP and TAZ control peripheral myelination and the expression of laminin receptors in Schwann cells. Nature Neuroscience. 19, 879-887 (2016).
check_url/fr/61496?article_type=t

Play Video

Citer Cet Article
Xu, Z., Orkwis, J. A., Harris, G. M. Preparation of Tunable Extracellular Matrix Microenvironments to Evaluate Schwann Cell Phenotype Specification. J. Vis. Exp. (160), e61496, doi:10.3791/61496 (2020).

View Video