Preparación de microambientes de matriz extracelular sintonizable para evaluar la especificación del fenotipo celular Schwann
Summary
Esta metodología tiene como objetivo ilustrar los mecanismos por los cuales las señales de matriz extracelular tales como rigidez del sustrato, composición de proteínas y morfología celular regulan el fenotipo de células Schwann (SC).
Abstract
Las lesiones traumáticas del sistema nervioso periférico (PNS) actualmente carecen de tratamientos adecuados para recuperar la recuperación funcional completa. Las células Schwann (SCs), como las principales células gliales del PNS, juegan un papel vital en la promoción de la regeneración del PNS mediante la desdiferenciación en un fenotipo celular regenerativo después de la lesión. Sin embargo, el estado desdiferenciado de los CC es difícil de mantener durante el período de tiempo necesario para la regeneración y se ve afectado por los cambios en la matriz extracelular circundante (ECM). Por lo tanto, determinar la compleja interacción entre los CC y el ECM diferente para proporcionar señales de potencial regenerativo de los CC es esencial. Para hacer frente a esto, se creó una estrategia en la que se adsorbieron diferentes proteínas ECM sobre un sustrato de polidimetilsiloxano (PDMS) que proporcionaba una plataforma donde se puede modular la rigidez y la composición de proteínas. Los SC se siembran sobre los sustratos sintonizables y se midieron las funciones celulares críticas que representan la dinámica del fenotipo SC. Para ilustrar la interacción entre la expresión de proteína SC y la morfología celular, se utilizaron y caracterizaron las diferentes densidades de siembra de SC, además de patrones celulares impresos de microcontacto individuales, y se caracterizaron por la tinción por inmunofluorescencia y la mancha occidental. Los resultados mostraron que las células con un área de propagación más pequeña y mayor extensión de alargamiento celular promovieron mayores niveles de marcadores fenotípicos regenerativos SC. Esta metodología no sólo comienza a desentrañar la relación significativa entre el ECM y la función celular de los SCs, sino que también proporciona pautas para la optimización futura de los biomateriales en la reparación de los nervios periféricos.
Introduction
Las lesiones del sistema nervioso periférico (PNS) siguen siendo un desafío clínico importante en la atención médica al comprometer la calidad de vida de los pacientes y crear un impacto significativo a través de una multitud de factores socioeconómicos1,,2. Las células Schwann (SC), como las principales células gliales en el PNS, proporcionan las señales moleculares y físicas necesarias para inducir la regeneración del PNS y ayudar en las recuperaciones funcionales en lesiones de brecha corta. Esto se debe a la notable capacidad de los SCs para desdiferenciar en un fenotipo celular de “reparación” de un fenotipo mielinizante o Remak3. El SC de reparación es un fenotipo celular distintivo de varias maneras. Después de la lesión, las CC aumentan su tasa de proliferación volviendo a entrar en el ciclo celular y comienzan la expresión de varios factores transcripcionales para facilitar la reinvervación. Estos factores, como c-Jun y p75 NTR, se regulan al alza mientras que los marcadores SC mielinantes, como la proteína básica de mielina (MBP), están regulados hacia abajo4,5. Además, los SCs cambian la morfología para que se alargar y se alineen entre sí para formar bandas de B-ngner a través del sitio de lesiones6. Esto proporciona un mecanismo de orientación física para que los axones se extiendan al objetivo distal correcto7. Sin embargo, a pesar de la capacidad que poseen los CC para promover la regeneración nerviosa en lesiones de brecha corta, el resultado de la recuperación funcional sigue siendo pobre en lesiones graves. Esto se debe en parte a una pérdida de indicaciones de orientación de matriz extracelular (ECM), así como a la incapacidad de los CC para mantener el fenotipo regenerativo durante largos períodos de tiempo8.
El proceso de regeneración y recuperación nerviosa está íntimamente ligado al estado de la lámina basal después de una lesión. La lámina basal es una capa de ECM alrededor del nervio que facilita la orientación y proporciona señales enlazadas a ECM para axones y SCs en los casos en que permanece intacta después de la lesión9. El estado del ECM y su capacidad para entregar señales de matriz enlazadas a las células es de vital importancia y se ha explorado previamente en una variedad de contextos diferentes10,,11,,12,,13,,14. Por ejemplo, se ha demostrado que la rigidez del ECM puede guiar funciones celulares como la proliferación y la diferenciación11,15,16. La composición del ECM también puede conducir a una respuesta celular distinta y regular los comportamientos celulares como la migración y la diferenciación a través de las vías de señalización intracelulares17,,18. Además, la morfología celular, incluida la zona de propagación y el alargamiento celular, desempeñan un papel importante en la regulación de la función y pueden regirse por las señales19,,20. Muchos estudios anteriores se han centrado en células madre que se diferencian en linajes definidos, sin embargo, las SC poseen una capacidad similar para alterar el fenotipo de un SC homeostático, adulto dentro de un nervio sano, a una reparaciones SC capaces de secretar proteínas y factores de crecimiento mientras se remodela el ECM después de la lesión nerviosa5,,21. Por lo tanto, es especialmente crucial identificar los mecanismos subyacentes a la relación entre la capacidad regenerativa de SC innata y las señales enlazadas a ECM para que la información aproveche en última instancia esta capacidad para la regeneración nerviosa.
Para abordar esto, hemos desarrollado una metodología detallada para producir un sustrato de cultivo celular donde la rigidez mecánica y el tipo de ligando se pueden ajustar fácilmente en rangos fisiológicamente relevantes. El siloxano de polidimetil (PDMS) fue elegido como sustrato debido a su mecánica altamente sintonizable en comparación con el gel de poliacrilamida, donde el módulo máximo de Young es de alrededor de 12 kPa contrastado con PDMS en alrededor de 1000 kPa22,,23,,24. Esto es beneficioso para el trabajo en cuestión, ya que estudios recientes han demostrado que el módulo de young de un nervio ciático de conejo puede superar los 50 kPa durante el desarrollo, lo que sugiere que el rango de rigidez de los nervios dentro del PNS es más amplio de lo examinado anteriormente. Diferentes proteínas son capaces de adsorción sobre sustratos de PDMS para analizar la regulación combinatoria de la mecánica y los ligandos sobre el comportamiento sc. Esto permite la investigación de múltiples señales microambienmentales presentes en el proceso de regeneración de PNS y la comparación de un alto grado de tunabilidad con el trabajo centrándose únicamente en la rigidez del sustrato25. Además, estos sustratos de cultivo celular de ingeniería son compatibles con una multitud de métodos de análisis cuantitativos como la inmunohistoquímica, la mancha occidental y la reacción cuantitativa en cadena de la polimerasa (q-PCR).
Esta plataforma de cultivo celular de ingeniería es muy adecuada para analizar vías mecanicistas debido al alto nivel de tunabilidad individual de cada señal enlazada a ECM. Además, se pueden lograr métodos populares para el micropatrón celular, incluida la impresión de microcontactos, en los sustratos para permitir la adhesión celular controlada para analizar la forma de la célula en relación con otras señales enlazadas a ECM24. Esto es fundamental porque los sustratos con patrón de línea, que promueven el alargamiento en las poblaciones celulares, proporcionan una herramienta para imitar y estudiar los SCs alargados y regenerativos dentro de las bandas de B-ngner durante la regeneración nerviosa. Además, la morfología celular es un potente regulador de múltiples funciones celulares y potencialmente puede introducir resultados experimentales confusos si no se controlan26,,27. Ahora se presta una atención significativa a los mecanismos que rigen el fenotipo regenerativo SC regulado por las señales28,29,,30del MEC. Esto es esencial para proporcionar información sobre el diseño de biomateriales que se pueden aplicar como conductos de orientación nerviosa para la ayuda en la regeneración nerviosa PNS. Estos protocolos detallados se pueden aplicar en última instancia como una herramienta potencial para descifrar los mecanismos de SC y otras funciones de tipo de células según lo regulado por señales enlazadas a ECM.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los CC pueden promover la regeneración nerviosa debido a su transformación fenotípica y potencial regenerativo después de una lesión nerviosa. Sin embargo, la forma en que las señales ECM regulan esta capacidad regenerativa sigue siendo en su mayoría poco clara, lo que puede obstaculizar no sólo el desarrollo de biomateriales que tienen como objetivo promover la regeneración nerviosa, sino también la comprensión de los mecanismos involucrados en la regeneración nerviosa. Para comenzar a examinar esta interacc…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen el apoyo de la Universidad de Cincinnati. Los autores también agradecen a Ron Flenniken, del laboratorio de caracterización de materiales avanzados de la Universidad de Cincinnati, por su apoyo.
Materials
| Albumin from Bovine Serum (BSA), Texas Red conjugate | Thermo Fisher Scientific | A23017 | BSA staining to show micropatterns |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7076S | Antibody used for western blot analysis |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7074S | Antibody used for western blot analysis |
| BrdU | Thermo Fisher Scientific | B23151 | Reagent used to measure cell proliferation |
| BrdU primary antibody conjugated with Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | B35130 | Used to visualize BrdU in cell proliferation assays |
| Collagen I | Thermo Fisher Scientific | A10483-01 | Protein used to coat coverslips |
| Compression force test machine | TestResources | Instrument to quantify mechanical properties of polymers | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | Cell culture medium |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | Cell culture medium supplemental |
| Fibronectin | Thermo Fisher Scientific | 33010-018 | Protein used to coat coverslips |
| Fluorescence microscope | Nikon | Eclipse Ti2 | Fluorescence microscope |
| Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) | Thermo Fisher Scientific | 78440 | Protease and Phosphatase Inhibitor |
| Laminin | Thermo Fisher Scientific | 23017015 | Protein used to coat coverslips |
| Mounting medium with DAPI | Thermo Fisher Scientific | P36971 | Coverslip mountant and nuclei staining |
| Mouse c-Jun primary antibody | Thermo Fisher Scientific | 711202 | Primary antibody to visualize c-Jun protein |
| Mouse β-Actin primary antibody | Cell Signaling Technology | 3700S | Loading control for western blot experiments |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Cell culture medium supplemental |
| Photoresist SU 2010 | KAYAKU | SU8-2010 | Photoresist |
| Pluronic F-127 | Sigma Aldrich | P-2443 | Block non-specific protein binding |
| Rabbit c-Jun primary antibody | Cell Signaling Technology | 9165S | Primary antibody for visualization of c-Jun protein |
| Rabbit myelin basic protein primary antibody | Abcam | ab40390 | Primary antibody for visualization of MBP |
| Rabbit p75NTR primary antibody | Cell Signaling Technology | 8238S | Primary antibody for visualization of p75NTR |
| Rhodamine phalloidin | Thermo Fisher Scientific | R415 | Visualization of cell cytoskeleton |
| RIPA buffer | Abcam | ab156034 | Cell lysis buffer |
| RT4-D6P2T Schwann cell line | ATCC | CRL-2768 | Cell line used in experiments |
| SYLGARD 184 PDMS base and curing agent | Sigma Aldrich | 761036 | Tunable polymer used to coat coverslips |
| Trypsin | Thermo Fisher Scientific | 15090-046 | Cell dissociation reagent |
| UV-Ozone cleaner | Novascan | Increase hydrophicility of PDMS | |
| Versene (1x) | Thermo Fisher Scientific | 15040066 | Cell dissociation reagent |
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