Preparazione di microambienti a matrice extracellulare tunable per valutare schwann Cell Phenotype Specification
Summary
Questa metodologia ha lo scopo di illustrare i meccanismi con cui i segnali di matrice extracellulare come la rigidità del substrato, la composizione delle proteine e la morfologia cellulare regolano il fenotipo delle cellule di Schwann (SC).
Abstract
Le lesioni del sistema nervoso periferico traumatico (PNS) attualmente non dispongono di trattamenti adeguati per recuperare il pieno recupero funzionale. Le cellule di Schwann (SC), come le principali cellule gliali del PNS, svolgono un ruolo vitale nel promuovere la rigenerazione del PNS dedifferenziando in un fenotipo cellulare rigenerativo a seguito di lesioni. Tuttavia, lo stato disdifferenziato delle SCs è difficile da mantenere durante il periodo di tempo necessario per la rigenerazione ed è influenzato dai cambiamenti nella matrice extracellulare circostante (ECM). Pertanto, è essenziale determinare la complessa interazione tra SC e ECM diverso per fornire indicazioni di potenziale rigenerativo delle SC. Per risolvere questo problema, è stata creata una strategia in cui diverse proteine ECM sono state assorbite su un substrato polidimethylsiloxane (PDMS) regolabile che ha fornito una piattaforma in cui la rigidità e la composizione delle proteine possono essere modulate. Le SC sono state seminate sui substrati regolabili e sono state misurate le funzioni cellulari critiche che rappresentano la dinamica del fenotipo SC. Per illustrare l’interazione tra l’espressione proteica SC e la morfologia cellulare, sono state utilizzate diverse densità di semità di SCs oltre ai singoli modelli cellulari stampati in microcontatto e caratterizzati da colorazione immunofluorescenza e macchie occidentali. I risultati hanno mostrato che le cellule con un’area di diffusione più piccola e una maggiore estensione dell’allungamento cellulare hanno promosso livelli più elevati di marcatori fenotipici rigenerativi SC. Questa metodologia non solo inizia a svelare la relazione significativa tra l’ECM e la funzione cellulare delle SC, ma fornisce anche linee guida per la futura ottimizzazione dei biomateriali nella riparazione dei nervi periferici.
Introduction
Le lesioni del sistema nervoso periferico (PNS) rimangono una grande sfida clinica nel settore sanitario compromettendo la qualità della vita dei pazienti e creando un impatto significativo attraverso una moltitudine di fattori socioeconomici1,2. Le cellule di Schwann (SC), in quanto le principali cellule gliali del PNS, forniscono i necessari segnali molecolari e fisici per indurre la rigenerazione del PNS e aiutare nei recuperi funzionali in lesioni di breve variazione. Ciò è dovuto alla notevole capacità delle SCs di disdifferenziarsi in un fenotipo cellulare “riparare” da un mielinante o remak fenotipo3. La riparazione SC è un fenotipo cellulare distintivo in diversi modi. In seguito a lesioni, le SC aumentano il loro tasso di proliferazione rientrando nel ciclo cellulare e iniziano l’espressione di diversi fattori trascrizionali per facilitare la reinnervazione. Questi fattori, come c-Jun e p75 NTR, sono upregulated mentre i marcatori SC mielinanti, come la proteina di base della mielina (MBP), sono downregolati4,5. Inoltre, le SC cambiano morfologia per allungarsi e allinearsi l’una con l’altra per formare bande di Bànner in tutto il sito di infortunio6. Questo fornisce un meccanismo di guida fisica per gli assoni per estendere al bersaglio distale corretto7. Tuttavia, nonostante la capacità che le SC possiedono per promuovere la rigenerazione dei nervi in lesioni di breve gap, l’esito del recupero funzionale rimane scarso in gravi lesioni. Ciò è dovuto in parte alla perdita di segnali guida ecm (Extracellular Matrix), così come all’incapacità delle SCs di mantenere il fenotipo rigenerativo per lunghi periodi di tempo8.
La rigenerazione del nervo e il processo di recupero sono intimamente legati allo stato della lamina basale a seguito di lesioni. La lamina basale è uno strato di ECM intorno al nervo che facilita la guida e fornisce spunti eCM-bound per assoni e SC nei casi in cui rimane intatto dopo la lesione9. Lo stato dell’ECM e la sua capacità di fornire segnali legati a matrice alle celle è di vitale importanza ed è stato precedentemente esplorato in una varietà di contesti diversi10,11,12,13,14. Ad esempio, è stato dimostrato che la rigidità dell’ECM può guidare le funzioni cellulari come la proliferazione e la differenziazione11,15,16. La composizione dell’ECM può anche portare a una risposta cellulare distinta e regolare i comportamenti cellulari come la migrazione e la differenziazione attraverso le vie di segnalazione intracellulare17,18. Inoltre, la morfologia cellulare, compresa l’area di diffusione e l’allungamento cellulare, svolgono un ruolo importante nella regolazione della funzione e possono essere regolate da segnali legati all’ECM19,20. Molti studi precedenti si sono concentrati sulla differenziazione delle cellule staminali in linee definite, ma le SC possiedono una capacità simile di alterare il fenotipo da un SC omeostatico e adulto all’interno di un nervo sano, a una SC di riparazione in grado di secernere proteine e fattori di crescita rimodellando l’ECM a seguito di lesioni nervose5,21. Pertanto, è particolarmente importante identificare i meccanismi alla base della relazione tra la capacità rigenerativa SC innata e i segnali legati all’ECM per l’intuizione per sfruttare in ultima analisi questa capacità di rigenerazione dei nervi.
Per risolvere questo problema, abbiamo sviluppato una metodologia dettagliata per produrre un substrato di coltura cellulare in cui rigidità meccanica e tipo di ligando possono essere facilmente sintonizzati in gamme fisiologicamente rilevanti. Il siloxane polidimetile (PDMS) è stato scelto come substrato a causa della sua meccanica altamente regolabile rispetto al gel di poliacritilminismo, dove il modulus massimo di Young è di circa 12 kPa a contrasto con PDMS a circa 1000 kPa22,23,24. Questo è utile per il lavoro a portata di mano, come recenti studi hanno dimostrato il modulo del giovane di un nervo sciatico coniglio può superare 50 kPa durante lo sviluppo, suggerendo così che la gamma di rigidità dei nervi all’interno del PNS è più ampia di quanto precedentemente esaminato. Diverse proteine sono in grado di adsorgere su substrati PDMS per analizzare la regolazione combinatoria della meccanica e dei ligandi sul comportamento SC. Ciò consente di sforare molteplici segnali microambientali presenti nel processo di rigenerazione PNS e il confronto di un elevato grado di sintonizzabilità con il lavoro concentrandosi esclusivamente sulla rigidità del substrato25. Inoltre, questi substrati di coltura cellulare ingegnerizzati sono compatibili con una moltitudine di metodi di analisi quantitativa come l’immunohistochimica, la macchia occidentale e la reazione a catena quantitativa della polimerasi (q-PCR).
Questa piattaforma di coltura cellulare ingegnerizzata è altamente adatta per l’analisi dei percorsi meccanicistici a causa dell’elevato livello di sintonfiabilità individuale di ogni segnale legato a ECM. Inoltre, i metodi popolari per il micropatterning cellulare, compresa la stampa di microcontatto, possono essere ottenuti sui substrati per consentire l’adesione cellulare controllata per analizzare la forma cellulare in relazione ad altri segnali eCM legati24. Questo è fondamentale perché i substrati modellati a linee, che promuovono l’allungamento nelle popolazioni cellulari, forniscono uno strumento per imitare e studiare le SC allungate e rigenerative all’interno delle bande di Bàngner durante la rigenerazione dei nervi. Inoltre, la morfologia cellulare è un potente regolatore di molteplici funzioni cellulari e può potenzialmente introdurre risultati sperimentali confusi se non controllati26,27. Viene ora prestata particolare attenzione ai meccanismi che regolano il fenotipo rigenerativo SC come regolato da segnali ECM28,29,30. Questo è essenziale per fornire informazioni sulla progettazione di biomateriali che possono essere applicati come condotti di guida nervosa per aiutare nella rigenerazione dei nervi PNS. Questi protocolli dettagliati possono infine essere applicati come un potenziale strumento per decifrare i meccanismi di SC e altri tipi di cellule funzionano come regolato da segnali legati ECM.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le SC possono promuovere la rigenerazione dei nervi a causa della loro trasformazione fenotipica e del potenziale rigenerativo in seguito a lesioni nervose. Tuttavia, il modo in cui i segnali ECM regolano questa capacità rigenerativa rimane per lo più poco chiaro, ostacolando potenzialmente non solo lo sviluppo di biomateriali che mirano a promuovere la rigenerazione dei nervi, ma anche la comprensione dei meccanismi coinvolti nella rigenerazione dei nervi. Per iniziare a esaminare questa interazione, sono stati creati…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori riconoscono con gratitudine il sostegno dei finanziamenti dell’Università di Cincinnati. Gli autori ringraziano anche Ron Flenniken del laboratorio di caratterizzazione avanzata dei materiali dell’Università di Cincinnati per il supporto.
Materials
| Albumin from Bovine Serum (BSA), Texas Red conjugate | Thermo Fisher Scientific | A23017 | BSA staining to show micropatterns |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7076S | Antibody used for western blot analysis |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7074S | Antibody used for western blot analysis |
| BrdU | Thermo Fisher Scientific | B23151 | Reagent used to measure cell proliferation |
| BrdU primary antibody conjugated with Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | B35130 | Used to visualize BrdU in cell proliferation assays |
| Collagen I | Thermo Fisher Scientific | A10483-01 | Protein used to coat coverslips |
| Compression force test machine | TestResources | Instrument to quantify mechanical properties of polymers | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | Cell culture medium |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | Cell culture medium supplemental |
| Fibronectin | Thermo Fisher Scientific | 33010-018 | Protein used to coat coverslips |
| Fluorescence microscope | Nikon | Eclipse Ti2 | Fluorescence microscope |
| Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) | Thermo Fisher Scientific | 78440 | Protease and Phosphatase Inhibitor |
| Laminin | Thermo Fisher Scientific | 23017015 | Protein used to coat coverslips |
| Mounting medium with DAPI | Thermo Fisher Scientific | P36971 | Coverslip mountant and nuclei staining |
| Mouse c-Jun primary antibody | Thermo Fisher Scientific | 711202 | Primary antibody to visualize c-Jun protein |
| Mouse β-Actin primary antibody | Cell Signaling Technology | 3700S | Loading control for western blot experiments |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Cell culture medium supplemental |
| Photoresist SU 2010 | KAYAKU | SU8-2010 | Photoresist |
| Pluronic F-127 | Sigma Aldrich | P-2443 | Block non-specific protein binding |
| Rabbit c-Jun primary antibody | Cell Signaling Technology | 9165S | Primary antibody for visualization of c-Jun protein |
| Rabbit myelin basic protein primary antibody | Abcam | ab40390 | Primary antibody for visualization of MBP |
| Rabbit p75NTR primary antibody | Cell Signaling Technology | 8238S | Primary antibody for visualization of p75NTR |
| Rhodamine phalloidin | Thermo Fisher Scientific | R415 | Visualization of cell cytoskeleton |
| RIPA buffer | Abcam | ab156034 | Cell lysis buffer |
| RT4-D6P2T Schwann cell line | ATCC | CRL-2768 | Cell line used in experiments |
| SYLGARD 184 PDMS base and curing agent | Sigma Aldrich | 761036 | Tunable polymer used to coat coverslips |
| Trypsin | Thermo Fisher Scientific | 15090-046 | Cell dissociation reagent |
| UV-Ozone cleaner | Novascan | Increase hydrophicility of PDMS | |
| Versene (1x) | Thermo Fisher Scientific | 15040066 | Cell dissociation reagent |
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