Questo protocollo descrive un’applicazione di fluorescenza a singola molecola in ibridazione situ (smFISH) per misurare la cinetica in vivo della sintesi e della degradazione dell’mRNA.
La fluorescenza a singola molecola nell’ibridazione in situ (smFISH) consente di contare il numero assoluto di mRNA nelle singole cellule. Qui, descriviamo un’applicazione di smFISH per misurare i tassi di trascrizione e degradazione dell’mRNA in Escherichia coli. Poiché smFISH si basa su cellule fisse, eseguiamo smFISH in più punti di tempo durante un esperimento di corso nel tempo, cioè quando le cellule sono sottoposte a cambiamenti sincronizzati in caso di induzione o repressione dell’espressione genica. In ogni momento, le sotto-regioni di un mRNA sono spettralmente distinte per l’allungamento della trascrizione della sonda e la terminazione prematura. Il risultato di questo protocollo consente anche di analizzare la localizzazione intracellulare degli mRNA e l’eterogeneità nei numeri di copia dell’mRNA tra le cellule. Utilizzando questo protocollo è possibile elaborare molti campioni (50 USD) entro 8 h, come la quantità di tempo necessaria per pochi campioni. Discutiamo come applicare questo protocollo per studiare la trascrizione e la cinetica di degradazione di diversi mRNA nelle cellule batteriche.
Il flusso di informazioni genetiche dal DNA all’mRNA e alle proteine è uno dei processi cellulari più fondamentali, la cui regolazione è importante per la forma fisicacellulare 1. Il numero di mRNA in una cella è determinato da due processi dinamici, la trascrizione e la degradazione dell’mRNA. Tuttavia, il modo in cui la trascrizione e la degradazione dell’mRNA sono regolate nel tempo e nello spazio di una singola cellula non rimane completamente compreso, in gran parte a causa della carenza di metodi sperimentali per misurare quantitativamente la loro cinetica in vivo.
I metodi basati su mRNA totali estratti da una popolazione di cellule, come Northern blot, RT-PCR, RNA sequencing e microarray di espressione genica, possono misurare la differenza relativa nei livelli di mRNA e sono stati ampiamente utilizzati per analizzare il tasso di allungamento della trascrizione2,3,4,5 o il tasso di degradazione dell’mRNA6,7. Tuttavia, non forniscono il numero assoluto di mRNA per cellula e, di conseguenza, non sono adatti per sondare il tasso di iniziazione della trascrizione8. Inoltre, poiché gli mRNA vengono estratti da una popolazione di cellule, la distribuzione spaziale degli mRNA all’interno di una singola cellula e la variabilità dei numeri di copia dell’mRNA tra le cellule non possono essere misurati.
Il sequenziamento dell’RNA di nuova generazione su singole cellule (scRNAseq) può quantificare il numero di mRNA per cellula in una scala genomica9. Tuttavia, rimane difficile utilizzare questa tecnica per misurare la cinetica della trascrizione, a causa di sfide con la preparazione del campione e il costo elevato. In particolare, l’applicazione di scRNAseq ai batteri è stata tecnicamente difficile a causa della bassa abbondanza di mRNA10,11.
La fluorescenza a singola molecola in situ ibridazione (smFISH) si basa sull’ibridazione di sonde a singolo filamento etichettate fluorescente le cui sequenze sono complementari all’mRNA di destinazionedi interesse 12,13. Il concetto di ibridazione specifica della sequenza è simile a quello utilizzato in Northern blot o RT-PCR, ma l’ibridazione viene eseguita in situ all’interno di celle fisse, per preservare la localizzazione nativa degli mRNA. Il segnale di un singolo mRNA viene amplificato utilizzando molte sonde, 20 nucleotidi (nt) di lunghezza, ibridando in diverse parti di un mRNA (Figura 1A)13. In questo approccio di sonda “piastrella”, il numero di sonde necessarie per rilevare un singolo mRNA imposta un limite inferiore alla lunghezza dell’mRNA che può essere analizzato. In alternativa, l’mRNA di interesse può essere scritratto in una matrice non codificante di sequenze di operatori lac tandem, in modo che più copie di una sonda lacO fluorescente si ibride in un singolo mRNA (Figura 1B)14.
smFISH è stato utilizzato per quantificare il numero di mRNA per cellula a stato costante (cioè, quando la sintesi e il decadimento sono in equilibrio) e per analizzare la media e la variabilità degli mRNA tra le cellule batteriche15,16,17. Recentemente, smFISH è stato applicato per quantificare i numeri di mRNA allo stato non stabile, subito dopo l’induzione o la repressione dell’espressione genica in E. coli18,19,20. Le variazioni temporali nei numeri di copia dell’mRNA assoluto sono state quindi utilizzate per calcolare il tasso di iniziazione della trascrizione, allungamento e terminazione, nonché il tasso di degradazione dell’mRNA. Per questa applicazione, le procedure smFISH convenzionali possono essere ingombranti perché ci sono molti campioni, ognuno dei quali rappresenta un punto di tempo, che devono passare attraverso più passaggi di scambio di buffer (ad esempio, centrifugazione e lavaggio). Qui, descriviamo un protocollo smFISH, in cui le fasi di movimentazione del campione sono notevolmente semplificate avendo cellule aderenti alla superficie di un coverslip e aspirando liquidi con un sistema di filtrazione del vuoto14,19. Utilizzando come esempio l’espressione di lac de E. coli, viene dimostrato il flusso di lavoro completo (Figura 2), inclusa l’analisi dell’immagine (Figura 3) che produce la cinetica in vivo della trascrizione (iniziazione, allungamento e terminazione) e la degradazione dell’mRNA, la variabilità da cellula a cellula nell’espressione mRNA e la localizzazione dell’mRNA. Prevediamo che il protocollo è ampiamente applicabile per sondare cinetica in vivo e localizzazione di altri mRNA in varie specie di batteri.
Qui, abbiamo presentato un protocollo smFISH per misurare la cinetica dell’mRNA in E. coli. Nei protocolli smFISH pubblicati in precedenza per i batteri23, le cellule sono state tenute nei tubi fino alla fine del protocollo, vale a di qui fino a quando non sono pronte per l’imaging. Anche se ha molti vantaggi, come l’associazione minima non specifica di sonde fluorescenti sulla superficie coverslip23, è difficile seguire questi protocolli quando ci sono molti campioni da un esperimento di corso di tempo. In primo luogo, un volume relativamente grande di cellule (>1 mL) deve essere campionato e persino raccolto prima della fissazione. In secondo luogo, i campioni di cellule devono essere centrifugati più volte per scambiare soluzioni e lavarsi dopo la fase di ibridazione. Nel nostro protocollo, un piccolo volume (<1 mL) di coltura viene direttamente miscelato con una soluzione di fissaggio in un tubo da 1,5 mL, contribuendo a "congelare" rapidamente lo stato della cella al momento del campionamento. Inoltre, le cellule rimangono attaccate alla superficie per tutta la procedura e diverse soluzioni possono essere scambiate rapidamente aspirando liquidi con un sistema di filtrazione del vuoto e applicando gocce di soluzione contemporaneamente con una pipetta multicanale. Questa differenza rende il nostro protocollo altamente vantaggioso quando un gran numero di campioni devono essere elaborati contemporaneamente. Utilizzando il nostro protocollo, 12-48 campioni possono essere gestiti contemporaneamente e l'intera procedura FISH può essere completata entro 8 ore, circa una quantità di tempo simile necessaria per alcuni campioni (Figura 2). Anche se abbiamo usato come esempio l’espressione di lac de E. coli, il protocollo è ampiamente applicabile a diversi geni e specie batteriche con considerazioni discusse di seguito.
Per i diversi geni, la prima cosa da considerare sono le sonde smFISH. Si possono progettare sonde oligonucleotide che affiancare l’mRNA di interesse (Figura 1A)13. In questo approccio di sonda “piastrellante”, ogni sonda è lunga 20 dollari ed etichettata con un fluoroforo al capolinea 5′ o 3′. Questa strategia è conveniente in quanto non è necessaria alcuna manipolazione genetica. In alternativa, una ripetizione tandem della sequenza di 20 bp, estranea alla sequenza genomica (ad esempio, una matrice di sequenza lacO de Caulobacter crescentus14), può essere inserita nella regione non tradotta di un gene di interesse e una singola sonda complementare all’unità di ripetizione viene utilizzata per etichettare l’mRNA (approccio “array”; Figura 1B). In entrambi i casi, più fluorofori decorano un mRNA, dando segnale di fluorescenza amplificato che può essere facilmente differenziato da una singola sonda legata in modo non specifico all’interno di una cellula.
La scelta di approcci “affiancamento” o “array” dipende dal controllo negativo, un campione in cui viene testata l’associazione non specifica delle sonde perché manca dell’mRNA di destinazione. Per le sonde di affiancamento (Figura 1A), un ceppo mutante senza il gene di interesse o una condizione, in cui il gene non è trascritto (ad esempio, la repressione del lac) può servire come controllo negativo per testare il legame non specifico delle sonde. Per l’oggetto basato su matrice ( ), un ceppo di tipo selvatico privo della matrice può fungere da controllo negativo perché non contiene siti di associazione per i probe.
Le condizioni di ibridazione ottimali possono dipendere dalle sequenze di sonda e persino dalla scelta dei coloranti fluoroforo. Abbiamo ottimizzato la condizione di ibridazione per i set di sonde lac, mantenendo la temperatura di ibridazione a 37 gradi centigradi e testando diverse concentrazioni di set di sonde e formamide nella soluzione di ibridazione. Concentrazioni più elevate di formamide tendono a ridurre sia l’associazione non specifica che la specificaassociazione 26,35. Si consiglia di cambiare sistematicamente l’ibridazione e le sue condizioni di lavaggio mantenendo lo stesso tempo di ibridazione e temperatura. Man mano che la condizione diventa più rigorosa, diminuiscono sia l’associazione non specifica che la diminuzione dell’associazione (Figura 6). È importante trovare un punto in cui l’associazione non specifica inizia a raggiungere al di sotto di una soglia accettabile senza compromettere ulteriormente l’associazione specifica. Ad esempio, è stato utilizzato il livello di segnale ottenuto senza sonde (“nessuna sonda”) come soglia (Figura 6).
Il metodo smFISH a due colori che etichetta due regioni separate di un mRNA è limitato a geni lunghi. Per misurare il tasso di allungamento della trascrizione, abbiamo approfittato del fatto che la lac è lunga (3075 bp) e la sua espressione può essere indotta da IPTG. Quando un gene è breve, è difficile progettare due set di sonde di affiancamento (vicino a 5′ e 3′ estremità) e risolvere il ritardo di tempo tra le apparizioni di regioni di mRNA da 5′ e 3′. In questo caso, si possono contare gli mRNA nascenti allo stato costante di smFISH e analizzarne la distribuzione con un modello analitico con il tasso di allungamento della trascrizione come parametrodi adattamento 20. Inoltre, quando un gene di interesse non è inducibile, si possono trattare le cellule con rifampicina al momento zero e misurare il cambiamento temporale nelle sottosocieti di mRNA 5′ e 3′. Il ritardo dalla diminuzione del segnale mRNA di 5′ a quello del segnale mRNA 3′ può quindi essere utilizzato per calcolare il tasso di allungamento della trascrizione come fatto inprecedenza 31.
Infine, il protocollo smFISH è versatile e può essere combinato con altri schemi di etichettatura. In precedenza, il locus del DNA è stato visualizzato insieme agli mRNA combinando mRNA FISH con DNA FISH14 o sistema fluorescente reporter-operatore20. I prodotti proteici possono essere visualizzati eseguendo l’immunofluorescenza insieme all’mRNA FISH14,36. Inoltre, può essere combinato con la microscopia tridimensionale super-risoluzione37 per visualizzare gli mRNA in tutte e tre ledimensioni 38,39.
The authors have nothing to disclose.
Questo protocollo è stato sviluppato da S.K. durante la sua ricerca post-dottorato nel laboratorio della dott.ssa Christine Jacobs-Wagner presso l’Howard Hughes Medical Institute e il Microbial Sciences Institute dell’Università di Yale. Ringraziamo il Dr. Jacobs-Wagner e i suoi membri del laboratorio per vari input durante lo sviluppo del metodo e Laura Troyer per la lettura critica del manoscritto. S.K. riconosce il sostegno del Searle Scholars Program; K.V. riconosce il sostegno del James Scholar Preble Research Award dell’Università dell’Illinois.
Bacterial strain | |||
Escherichia coli MG1655 | |||
Chemicals, peptides, and others | |||
Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34851 | UPLC buffer B |
Ammonium chloride | Fisher Chemical | A661-500 | To make M9 medium |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | B2518 | Probe hybridization |
Calcium chloride | Acros Organics | 349610250 | To make M9 medium |
Casamino acid | BD Difco | 223050 | To make M9 medium |
Cy3B NHS ester | GE Healthcare Life Sciences | PA63101 | Fluorophore for FISH probes |
Cy5 NHS ester | GE Healthcare Life Sciences | PA15101 | Fluorophore for FISH probes |
DEPC | Sigma-Aldrich | D5758 | |
Dextran sulfate | Millipore | S4030 | Probe hybridization |
Dextrose | Fisher Chemical | D16 | To repress the expression of lacZ |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | To dissolve fluorophores |
E. coli tRNA | Sigma-Aldrich | R1753 | Probe hybridization |
Ethanol | Decon Laboratories | 2701 | Used in DNA purification, lysis, and cleaning coverslips |
FISH probes | Biosearch Technologies | Sequences are published in ref#16 | |
Formaldehyde | Ladd Research Industries | 20295 | Fixation |
Formamide | American Bio | AB00600 | Probe hybridization, pre-hybridization, and wash |
Glycerol | Americanbio | AB00751-01000 | To make M9 medium |
Isopropylthio-β-galactoside (IPTG) | Invitrogen | 15529019 | lacZ induction |
Magnesium sulfate | Fisher Chemical | M65-500 | To make M9 medium |
2-Nitrophenyl β-D-fucopyranoside (ONPF) | Santa Cruz Biotechnology | sc-216258 | lacZ repression |
Picodent twinsil 22 | Picodent | 1300 1000 | Sealant |
Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | To treat the coverslip surface |
Potassium chloride | Fisher BioReagents | BP366-500 | To make PBS |
Potassium phosphate monobasic | Fisher BioReagents | BP362-500 | To make PBS and M9 medium |
Rifampicin | Sigma-Aldrich | R3501 | To stop transcription initiation |
Saline-sodium citrate buffer (SSC) | Invitrogen | AM9763 | Probe hybridization, pre-hybridization, and wash |
sodium bicarbonate | Fisher BioReagents | BP328-500 | Fluorophore-probe conjugation |
Sodium chloride | Fisher BioReagents | BP358-1 | For DNA purification, PBS and M9 medium |
Sodium phosphate dibasic | Fisher BioReagents | BP332-500 | To make PBS and M9 medium |
Sodium phosphate monobasic | Fisher BioReagents | BP329-500 | To make a sodium phosphate buffer |
Super PAP Pen | Invitrogen | 8899 | Hydrophobic marker for coverslips |
TetraSpek microspheres | Invitrogen | T7280 | Controls for multi-channel registration |
Thiamine | Sigma-Aldrich | T1270 | To make M9 medium |
Triethylammonium acetate | Sigma-Aldrich | 90358 | UPLC buffer A |
Vanadyl ribonucleoside complex (VRC) | Sigma-Aldrich | 94742 | Probe hybridization and pre-hybridization |
Equipment | |||
C18 column | Waters | Acquity BEH C18 column | |
Countertop centrifuge | Eppendorf | 5425 | |
Countertop incubator | Eppendorf | Thermomixer F1.5 | |
Incubator (Oven) | Thermo Scientific | 51030514 | Gravity convection |
Water purification system | Millipore | Milli-Q Reference | |
Nanodrop | Thermo Scientific | 2000C | |
Nitrogen gas | Building | For blow-drying coverslips and glass slides | |
UPLC | Waters | Acquity UPLC system | |
Vacuum and aspirator | Building | Aspirator is made of a filtration flask with a side arm. | |
Vacuum concentrator | Labconco | 7810010 | Centrivap; to dry samples collected from UPLC. |
Vortexer | Scientific Industries | Genie-2 SI-0236 | |
Water bath shaker | New Brunswick | Innova 3100 | Critical for time-course experiments |
Water bath sonicator | VWR | 97043-960 | To clean coverslips and glass slides |
Tools | |||
1.5-mL tubes | Eppendorf | 22431021 | DNA lobind tubes |
1000-uL pipette tip box | Denville Scientific | P1126 | An empty box after using all the tips |
Coplin jar | SPI | 01240-AB | To clean coverslips and glass slides |
Coverslip | Fisher Scientific | 22-050-230 | 24×60 No1 |
Filtered pipette tips | Denville Scientific | P1121,P1122,P1126 | SHARP® Precision Barrier Tips |
Forceps | SPI | K35a | To handle clean coverslips and glass slides |
Glass slide | Fisher Scientific | 12-544-1 | |
Gloves | Microflex | MK-296-M | |
Multichannel pipetter | Eppendorf | 2231300045 | To use in the washing step (#7) |
Pipette | Gilson | P1000, P200, P20 | |
Reagent reservoir | MTC Bio | P8025-1S | To use in the washing step (#7) |
Syringe filter (0.22 um) | Millipore | SLGS033SS | |
Timer | VWR | 62344-641 | |
Software and algorithms | |||
MATLAB | Mathworks | R2013 and up | https://www.mathworks.com |
MicrobeTracker or Oufti | https://www.github.com/JacobsWagnerLab/MicrobeTracker | ||
https://oufti.org/ | |||
Stellaris Probe Designer | Biosearch Technologies | https://www.biosearchtech.com/support/tools/design-software/stellaris-probe-designer | |
Microscope | |||
CCD camera | Hamamatsu Photonics | Orca-II-ER | |
Cy3 filter set | Chroma | 49004 | |
Cy5 filter set | Chroma | 49006 | |
Epi-fluorescence microscope | Nikon | Eclipse Ti | For phase-contrast and epi fluorescence |
Fluorescence excitation source | Lumencor | SOLA-E | |
Nikon Elements software | Nikon | software that controls the microscope setup | |
Phase-contrast 100x objective | Nikon | Plan Apochromat (NA 1.45) | |
Probe sequence | |||
DNA oligos with C6 amino modification at the 5' end | Biosearch Technologies Inc | ||
lacZ1 | GTGAATCCGTAATCATGGTC | 5' mRNA | |
lacZ2 | TCACGACGTTGTAAAACGAC | 5' mRNA | |
lacZ3 | ATTAAGTTGGGTAACGCCAG | 5' mRNA | |
lacZ4 | TATTACGCCAGCTGGCGAAA | 5' mRNA | |
lacZ5 | ATTCAGGCTGCGCAACTGTT | 5' mRNA | |
lacZ6 | AAACCAGGCAAAGCGCCATT | 5' mRNA | |
lacZ7 | AGTATCGGCCTCAGGAAGAT | 5' mRNA | |
lacZ8 | AACCGTGCATCTGCCAGTTT | 5' mRNA | |
lacZ9 | TAGGTCACGTTGGTGTAGAT | 5' mRNA | |
lacZ10 | AATGTGAGCGAGTAACAACC | 5' mRNA | |
lacZ11 | GTAGCCAGCTTTCATCAACA | 5' mRNA | |
lacZ12 | AATAATTCGCGTCTGGCCTT | 5' mRNA | |
lacZ13 | AGATGAAACGCCGAGTTAAC | 5' mRNA | |
lacZ14 | AATTCAGACGGCAAACGACT | 5' mRNA | |
lacZ15 | TTTCTCCGGCGCGTAAAAAT | 5' mRNA | |
lacZ16 | ATCTTCCAGATAACTGCCGT | 5' mRNA | |
lacZ17 | AACGAGACGTCACGGAAAAT | 5' mRNA | |
lacZ18 | GCTGATTTGTGTAGTCGGTT | 5' mRNA | |
lacZ19 | TTAAAGCGAGTGGCAACATG | 5' mRNA | |
lacZ20 | AACTGTTACCCGTAGGTAGT | 5' mRNA | |
lacZ21 | ATAATTTCACCGCCGAAAGG | 5' mRNA | |
lacZ22 | TTTCGACGTTCAGACGTAGT | 5' mRNA | |
lacZ23 | ATAGAGATTCGGGATTTCGG | 5' mRNA | |
lacZ24 | TTCTGCTTCAATCAGCGTGC | 5' mRNA | |
lacZ25 | ACCATTTTCAATCCGCACCT | ||
lacZ26 | TTAACGCCTCGAATCAGCAA | ||
lacZ27 | ATGCAGAGGATGATGCTCGT | ||
lacZ28 | TCTGCTCATCCATGACCTGA | ||
lacZ29 | TTCATCAGCAGGATATCCTG | ||
lacZ30 | CACGGCGTTAAAGTTGTTCT | ||
lacZ31 | TGGTTCGGATAATGCGAACA | ||
lacZ32 | TTCATCCACCACATACAGGC | ||
lacZ33 | TGCCGTGGGTTTCAATATTG | ||
lacZ34 | ATCGGTCAGACGATTCATTG | ||
lacZ35 | TGATCACACTCGGGTGATTA | ||
lacZ36 | ATACAGCGCGTCGTGATTAG | ||
lacZ37 | GATCGACAGATTTGATCCAG | ||
lacZ38 | AAATAATATCGGTGGCCGTG | ||
lacZ39 | TTTGATGGACCATTTCGGCA | ||
lacZ40 | TATTCGCAAAGGATCAGCGG | ||
lacZ41 | AAGACTGTTACCCATCGCGT | ||
lacZ42 | TGCCAGTATTTAGCGAAACC | ||
lacZ43 | AAACGGGGATACTGACGAAA | ||
lacZ44 | TAATCAGCGACTGATCCACC | ||
lacZ45 | GGGTTGCCGTTTTCATCATA | ||
lacZ46 | TCGGCGTATCGCCAAAATCA | ||
lacZ47 | TTCATACAGAACTGGCGATC | ||
lacZ48 | TGGTGTTTTGCTTCCGTCAG | ||
lacZ49 | ACGGAACTGGAAAAACTGCT | 3' mRNA | |
lacZ50 | TATTCGCTGGTCACTTCGAT | 3' mRNA | |
lacZ51 | GTTATCGCTATGACGGAACA | 3' mRNA | |
lacZ52 | TTTACCTTGTGGAGCGACAT | 3' mRNA | |
lacZ53 | GTTCAGGCAGTTCAATCAAC | 3' mRNA | |
lacZ54 | TTGCACTACGCGTACTGTGA | 3' mRNA | |
lacZ55 | AGCGTCACACTGAGGTTTTC | 3' mRNA | |
lacZ56 | ATTTCGCTGGTGGTCAGATG | 3' mRNA | |
lacZ57 | ACCCAGCTCGATGCAAAAAT | 3' mRNA | |
lacZ58 | CGGTTAAATTGCCAACGCTT | 3' mRNA | |
lacZ59 | CTGTGAAAGAAAGCCTGACT | 3' mRNA | |
lacZ60 | GGCGTCAGCAGTTGTTTTTT | 3' mRNA | |
lacZ61 | TACGCCAATGTCGTTATCCA | 3' mRNA | |
lacZ62 | TAAGGTTTTCCCCTGATGCT | 3' mRNA | |
lacZ63 | ATCAATCCGGTAGGTTTTCC | 3' mRNA | |
lacZ64 | GTAATCGCCATTTGACCACT | 3' mRNA | |
lacZ65 | AGTTTTCTTGCGGCCCTAAT | 3' mRNA | |
lacZ66 | ATGTCTGACAATGGCAGATC | 3' mRNA | |
lacZ67 | ATAATTCAATTCGCGCGTCC | 3' mRNA | |
lacZ68 | TGATGTTGAACTGGAAGTCG | 3' mRNA | |
lacZ69 | TCAGTTGCTGTTGACTGTAG | 3' mRNA | |
lacZ70 | ATTCAGCCATGTGCCTTCTT | 3' mRNA | |
lacZ71 | AATCCCCATATGGAAACCGT | 3' mRNA | |
lacZ72 | AGACCAACTGGTAATGGTAG | 3' mRNA |