Экономически эффективный и адаптируемый анализ миграции царапин
Summary
Мы представляем экономически эффективный метод анализа миграции царапин, который обеспечивает новый подход к определению миграции клеток без использования интенсивных методов. Хотя фибробласты были использованы в этом протоколе, он может быть адаптирован и использован для изучения дополнительных типов клеток и влияний на миграцию клеток.
Abstract
Миграция клеток является ключевым компонентом как физиологических, так и патологических явлений. Нормальная миграция клеток необходима для основных функций, таких как развитие и монтаж иммунного ответа. Когда дефект или изменение происходит с процессом миграции клеток, это может иметь пагубные последствия (т.е. метастазы рака, заживление ран, и рубцовое образование). В связи с важностью миграции клеток необходимо иметь доступ к анализу миграции клеток, который является доступным, адаптируемым и повторяемым. Используя общий анализ миграции царапин, мы разработали новый подход к анализу миграции клеток, использующий общее лабораторное оборудование. В описанном методе используются визуальные маркеры, позволяющие отвоевать конкретные области, представляющие интерес, без использования замедленной микроскопии. Кроме того, он обеспечивает гибкость в экспериментальной конструкции, начиная от изменения субстрата матрицы миграции и до добавления фармакологических модификаторов. Кроме того, в этом протоколе излагается способ учета области миграции клеток, который не учитывается несколькими методами при изучении миграции ячееок. Этот новый подход предлагает анализ миграции царапин для более широкой аудитории и предоставит больше возможностей для исследователей, чтобы изучить физиологическое и патофизиологическое воздействие миграции клеток.
Introduction
Миграция клеток имеет решающее значение для многих физиологических, а также патологических событий. Это необходимо во время развития, для монтажа иммунного ответа, а также для правильногозаживления ран 1,2,3. Многие из этих событий миграции клеток могут быть вызваны физическими или химическими сигналами. Например, во время иммунного ответа, лейкоциты будут мигрировать к месту травмы в ответ на химиотерапию2. Кроме того, лейкоциты будут также выпускать цитокины, чтобы вызвать миграцию дополнительных иммунных клеток, а также других типов клеток, таких как фибробласты, которые участвуют в процессе заживления ран, и, таким образом, инициируя многоклеточныйответ 4. Способность клеток мигрировать имеет важное значение для правильной физиологической функции; однако, когда миграция клеток проходит бесконтрольно, она может иметь неблагоприятную реакцию и способствовать патологическим событиям, таким как хроническое воспаление, сосудистые заболевания, метастазырака, и нарушение заживления ран 2,3,4,5,6,7. Нарушение заживления ран является распространенным недугом диабетиков из-за дефектов в миграции клеток, и если эти дефекты не рассматриваются, это может привести к дальнейшим осложнениям (например,ампутация 8,9). Это исследование, как и другие, указали на необходимость дальнейшего понимания процесса, с помощью которого происходит миграция клеток, либо при нормальных физиологических или патологических условиях, и это имеет жизненно важное значение для дальнейшего этой области исследований. Для достижения этой цели необходимо провести миграционные анализы, которые были бы доступны и доступны для тех исследователей, которые могут не обладать оборудованием, необходимым для проведения этих анализов.
В настоящее время имеются различные миграционные анализы для изучения широкого круга вопросов, касающихся миграции клеток. Разработаны как 2D, так и 3D-модели миграции, каждая из которых ориентирована на конкретные области, влияющие на миграцию клеток. 3D-модели миграции, как правило, связаны с исследованиями вторжения клеток и оценивают влияние внеклеточной матрицына миграцию клеток 10,11,12, в то время как 2D-анализы миграции имеют больший диапазон применения и в первую очередь используются для изучения химиотатической миграции, заживления ран и функциональных изменений вовремя миграции клеток 13,14,15,16. Некоторые из этих анализов требуют дополнительного оборудования, таких как камеры Бойдена или кольца исключения, которые могут уменьшить доступность этих анализов для некоторых исследователей. Одним из наиболее экономически эффективных анализов является анализ царапин, который обычно используется для оценки заживления ран и общих изменений вмиграции клеток 14,17. В то время как большинство лабораторий оснащены для проведения анализа царапин, оборудование, используемое для отслеживания миграции клеток, как правило, либо недоступно, либо слишком дорого для покупки. Это включает в себя промежуток времени микроскопии, которая требует перевернутого микроскопа и живой системы визуализации. Эти дорогие единицы оборудования не являются общедоступными для каждой лаборатории. Таким образом, это наблюдение подчеркивает необходимость нового протокола, который позволяет оценить миграцию клеток с более доступным оборудованием.
Представленный здесь протокол предоставляет новый и доступный способ оценки миграции клеток. Этот метод следует той же процедуре, связанной с анализом царапин, но отличается в анализе изучения миграции клеток, используя оборудование, более широко доступное в лабораторных условиях фундаментальных наук. Этот протокол с использованием общего оборудования позволяет более точно определить миграцию клеток без использования замедленной микроскопии. Помимо определения миграции, этот метод также определяет переменные факторы в области царапин, которые, как было отмечено, оказывают значительное влияние на миграцию клеток. В целом, этот новый протокол для анализа миграции клеток дает возможность для большего числа лабораторий изучить и внести свой вклад в область миграции клеток.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот новый подход к анализу миграции царапин обеспечивает более доступный метод для исследователей для изучения изменений в миграции клеток. Хотя этот анализ следует той же процедуре для администрирования царапины похож на другие анализы нуля, он предоставляет новый метод для визуал?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа поддерживается Армии США медицинских исследований премии #81XWH-16-1-0710, Университет Миссисипи школы фармации и Кафедра биомолекулярных наук.
Materials
| Adobe All Apps | Adobe | This includes Adobe photoshop which is the imaging software used with this protocol | |
| Avant Pipette Tips 200ul Binding non-sterile | MIDSCI | AVR1 | Tips are autoclaved to sterilize |
| AxioCam Erc 5s Camera | Zeiss | 426540-9901-000 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Fisher Scientific | BP101-25 | |
| Costar Flat Bottom Cell Culture Plates 48 Wells | Fisher Scientific | 07-200-86 | |
| DMEM with L-Glutamine, 1g/L glucose and sodium pyruvate | Fisher Scientific | MT10014CM | |
| Image J | NIH | This is a free software offered by the US government and is the analysis software used with this protocol | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | AC416785000 | |
| Premium US origin fetal bovine serum | Innovative Research | IFBS-HU | |
| Primocin | InvivoGEN | ant-pm-2 | This is the anitmicrobial used for with this procotol to culture cardiac fibroblasts |
| Zeiss Primovert Microscope | Zeiss | 491206-0002-000 | |
| Zen Blue Edition 2.3 software | Zeiss | software comes with camera purchase |
References
- Gilbert, S. F. . Developmental biology. , (1997).
- Luster, A. D., Alon, R., Von Andrian, U. H. Immune cell migration in inflammation: present and future therapeutic targets. Nature Immunology. 6, (2005).
- Yahata, Y., et al. A Novel Function of Angiotensin II in Skin Wound Healing Induction of Fibroblast and Keratinocyte Migration by Angiotensin II via Heparin-Binding Epidermal Growth Factor (EGF)-like Growth Factor-Mediated EGF Receptor Transactivation. The Journal of Biological Chemistry. 281 (19), 13209-13216 (2006).
- Trepat, X., Chen, Z., Jacobson, K. Cell Migration Single-Cell Migration. Comprehensive Physiology. 2 (4), (2012).
- Brand, S., et al. IL-22 is increased in active Crohn’s disease and promotes proinflammatory gene expression and intestinal epithelial cell migration. American Journal of Physiology: Gastrointestinal and Liver Physiology. 290, 827-838 (2006).
- Chi, Z., Melendez, A. J. Role of Cell Adhesion Molecules and Immune-Cell Migration in the Initiation, Onset and Development of Atherosclerosis. Cell Adhesion & Migration. 1 (4), 171-175 (2007).
- Chen, H., Nalbantoglu, J. Ring cell migration assay identifies distinct effects of extracellular matrix proteins on cancer cell migration. BMC Research Notes. 7 (183), 1-9 (2014).
- Stewart, J. A., Massey, E. P., Fix, C., Zhu, J., Goldsmith, E. C., Carver, W. Temporal alterations in cardiac fibroblast function following induction of pressure overload. Cell and tissue research. 340 (1), 117-126 (2010).
- Darby, I. A., Laverdet, B., Bonté, F., Desmoulière, A. Fibroblasts and myofibroblasts in wound healing. Clinical, Cosmetic and Investigational Dermatology. , 7 (2014).
- Kramer, N., et al. In vitro cell migration and invasion assays. Mutation Research – Reviews in Mutation Research. 752 (1), 10-24 (2013).
- Even-Ram, S., Yamada, K. M. Cell migration in 3D matrix. Current Opinion in Cell Biology. (17), 524-532 (2005).
- Valster, A., et al. Cell migration and invasion assays. Methods. 37, 208-215 (2005).
- Pijuan, J., et al. In vitro cell migration, invasion, and adhesion assays: From cell imaging to data analysis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 1-16 (2019).
- Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).
- Hulkower, K. I., Herber, R. L. Cell migration and invasion assays as tools for drug discovery. Pharmaceutics. 3 (1), 107-124 (2011).
- Walter, M. N. M., Wright, K. T., Fuller, H. R., MacNeil, S., Johnson, W. E. B. Mesenchymal stem cell-conditioned medium accelerates skin wound healing: An in vitro study of fibroblast and keratinocyte scratch assays. Experimental Cell Research. 316 (7), 1271-1281 (2010).
- Chaudhary, A., Bag, S., Barui, A., Banerjee, P., Chatterjee, J. Honey dilution impact on in vitro wound healing: Normoxic and hypoxic condition. Wound Repair and Regeneration. 23 (3), 412-422 (2015).
- Lipton, A., Klinger, I., Paul, D., Holleyt, R. W. Migration of Mouse 3T3 Fibroblasts in Response to a Serum Factor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 68 (11), (1971).
- Ascione, F., Guarino, A. M., Calabrò, V., Guido, S., Caserta, S. A novel approach to quantify the wound closure dynamic. Experimental Cell Research. (352), 175-183 (2017).
- Burr, S. D., Harmon, M. B., S, J. A. The Impact of Diabetic Conditions and AGE/RAGE Signaling on Cardiac Fibroblast Migration. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, (2020).
- Chang, S. S., Guo, W. H., Kim, Y., Wang, Y. L. Guidance of Cell Migration by Substrate Dimension. Biophysical Journal. 104, 313-321 (2013).
- Nguyen-Ngoc, K. V., et al. ECM microenvironment regulates collective migration and local dissemination in normal and malignant mammary epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (39), 2595-2604 (2012).
