תס"א של העברת שריטות חסכונית ותואמה
Summary
אנו מציגים שיטה חסכונית לגיירת השריטות המספקת גישה חדשה לקביעת העברת תאים ללא שימוש בשיטות עתירות ציוד. בעוד פיברובלסטים שימשו בפרוטוקול זה, זה יכול להיות מותאם ומנוצל כדי ללמוד סוגי תאים נוספים והשפעות על העברת תאים.
Abstract
העברת תאים היא מרכיב מרכזי הן באירועים פיזיולוגיים והן באירועים פתולוגיים. העברת תאים רגילה נדרשת עבור פונקציות חיוניות כגון פיתוח והרכבה של תגובה חיסונית. כאשר מתרחש פגם או שינוי עם תהליך העברת התא, זה יכול להיות תוצאות מזיקות (כלומר, גרורות סרטן, ריפוי הפצע, היווצרות צלקת). בשל החשיבות של העברת תאים, יש צורך בגישה להעברה סלולרית, הניתנת להתאמה ותוכלית לחזרה. תוך שימוש בהגידת השריטות הנפוצה, פיתחנו גישה חדשה לניתוח נדידת תאים המשתמשת בציוד מעבדה כללי. השיטה המתוארת משתמשת בסמנים חזותיים המאפשרים לכידת אזורים מסוימים בעלי עניין ללא שימוש במיקרוסקופ זמן-לשגות. בנוסף, היא מספקת גמישות בעיצוב הניסיוני, החל משינוי המטריצת הנדידה ועד לתוספת של משנה תרופתי. יתר על כן, פרוטוקול זה מתאר דרך לתת דין וחשבון על האזור של העברת תאים, אשר אינו נחשב על-ידי מספר שיטות בעת בדיקת העברת תאים. גישה חדשה זו מציעה אסיא הגירה שריטה לקהל גדול יותר ותספק הזדמנות גדולה יותר לחוקרים לבחון את ההשפעה הפיזיולוגית והפתופיזיולוגית של העברת תאים.
Introduction
העברת תאים היא חיונית עבור אירועים פיזיולוגיים רבים, כמו גם פתולוגיים. הוא נדרש במהלך הפיתוח, להרכבת תגובה חיסונית, ולריפויפצעים נאותים 1,2,3. רבים מאירועי העברת תאים אלה יכולים להיות מופעלים על ידי אותות פיזיקליים או כימיים. לדוגמה, במהלך תגובה חיסונית, leukocytes לנדדו לעבר אתר של פציעה בתגובה כימותרפיה2. בנוסף, leukocytes גם לשחרר ציטוקינות כדי לגרום הגירה של תאים חיסוניים נוספים, כמו גם סוגי תאים אחרים, כגון פיברובלסטים, אשר מעורבים בתהליך ריפוי הפצע, ובכך, ייזום תגובה רבתאית 4. היכולת של תאים לנדוד חיונית לתפקוד פיזיולוגי תקין; עם זאת, כאשר נדידת תאים עוברת ללא בדיקה, זה יכול להיות תגובה שלילית ולתרום לאירועים פתולוגיים, כגון דלקת כרונית, מחלת כלי דם, גרורות סרטן, וריפוי פצעלקוי 2,3,4,5,6,7. ריפוי פצעים לקויים הוא סבל נפוץ של חולי סוכרת עקב פגמים בנדידה לתאים, ואם פגמים אלה אינם מטופלים, זה יכול להוביל לסיבוכים נוספים (למשל,קטיעה 8,9). מחקר זה, כמו גם אחרים, הצביעו על הצורך להבין עוד יותר את התהליך שבו מתרחשת נדידת תאים, בתנאים פיזיולוגיים או פתולוגיים רגילים, והוא חיוני גם להם לאורך תחום מחקר זה. כדי להשיג זאת, צריך להיות הגירה זמין כי הם נגישים ובמחיר סביר עבור אותם חוקרים, מי לא יכול להיות בעל הציוד הדרוש כדי לנהל את ההתאסות האלה.
נכון לכך, קיימים מגוון של העברות הזמינות לבחינת מגוון רחב של נושאים הנוגעים להעברה של תאים. פותחו מודלים של העברה תלת-מיתית ותלת-מיוד, שכל אחד מהם מתמקד באזורים ספציפיים המשפיעים על העברת תאים. מודלים נדידת 3D קשורים בדרך כלל מחקרים פלישת תאים ולהעריך את ההשפעה של מטריצהחוץ תאיתעל נדידת תאים 10,11,12, בעוד 2D הגירה יש מגוון גדול יותר של יישום והם משמשים בעיקר כדי ללמוד הגירה chemotactic, ריפוי פצעים, ושינויים פונקציונלייםבמהלך נדידת תאים 13,14,15,16. חלק מהאסמים הללו דורשים ציוד נוסף, כגון תאי ביידן או טבעות הדרה, מה שיכול להפחית את הזמינות של בדיקות אלה לחוקרים מסוימים. אחד האברים חסכוניים יותר הוא אחסון השריטות, המשמש בדרך כלל להערכת ריפוי פצעים ושינויים כללייםבהדחת תאים 14,17. בעוד רוב המעבדות מצוידות לנהל אחסון שריטה, הציוד המשמש למעקב אחר העברת תאים נוטים להיות גם לא זמין או יקר מדי לרכישה. זה כולל מיקרוסקופ זמן לשגות, אשר דורש מיקרוסקופ הפוך ומערכת הדמיה חיה. פריטי ציוד יקרים אלה אינם נגישים בדרך כלל לכל מעבדה. לכן, תצפית זו מדגישה את הצורך בפרוטוקול חדש המאפשר הערכה של העברת תאים עם ציוד זמין יותר.
הפרוטוקול המוצג כאן מספק דרך חדשה ובמחיר סביר להעריך את העברת התאים. שיטה זו פועלת על פי אותו הליך המשויך לבדיקות שריטה אך שונה בניתוח של בדיקת העברת תאים על-ידי שימוש בציוד הזמין בדרך כלל בהגדרת מעבדה בסיסית במדעים. פרוטוקול זה באמצעות ציוד משותף מאפשר קביעה מדויקת יותר של העברת תאים ללא שימוש במיקרוסקופ זמן-לשגות. בנוסף לקביעת ההעברה, שיטה זו מהווה גם גורמים משתנים באזור השריטה אשר הונו להשפיע מאוד על העברת תאים. בסך הכל, פרוטוקול חדש זה לניתוח העברת תאים מספק הזדמנות למעבדות נוספות לחקור ולתרום לתחום העברת התאים.
Protocol
Representative Results
Discussion
גישה חדשה זו לבחינת העברת השריטות מספקת שיטה נגישה יותר לחוקרים לבחון שינויים בהדברת תאים. בעוד הודעה זו פועלת על פי אותו הליך לניהול שריטה דומה למאגרים אחרים של שריטה, היא מספקת שיטה חדשה להדמיה וניתוח מדויק של העברת תאים10. במקום להשתמש בשיטות עתירות ציוד של מיקרוסקופית זמן-?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת על ידי פרס המחקר הרפואי של צבא ארה”ב #81XWH-16-1-0710, בית הספר לרוקחות של אוניברסיטת מיסיסיפי והמחלקה למדעים ביו-מולקולריים.
Materials
| Adobe All Apps | Adobe | This includes Adobe photoshop which is the imaging software used with this protocol | |
| Avant Pipette Tips 200ul Binding non-sterile | MIDSCI | AVR1 | Tips are autoclaved to sterilize |
| AxioCam Erc 5s Camera | Zeiss | 426540-9901-000 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Fisher Scientific | BP101-25 | |
| Costar Flat Bottom Cell Culture Plates 48 Wells | Fisher Scientific | 07-200-86 | |
| DMEM with L-Glutamine, 1g/L glucose and sodium pyruvate | Fisher Scientific | MT10014CM | |
| Image J | NIH | This is a free software offered by the US government and is the analysis software used with this protocol | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | AC416785000 | |
| Premium US origin fetal bovine serum | Innovative Research | IFBS-HU | |
| Primocin | InvivoGEN | ant-pm-2 | This is the anitmicrobial used for with this procotol to culture cardiac fibroblasts |
| Zeiss Primovert Microscope | Zeiss | 491206-0002-000 | |
| Zen Blue Edition 2.3 software | Zeiss | software comes with camera purchase |
References
- Gilbert, S. F. . Developmental biology. , (1997).
- Luster, A. D., Alon, R., Von Andrian, U. H. Immune cell migration in inflammation: present and future therapeutic targets. Nature Immunology. 6, (2005).
- Yahata, Y., et al. A Novel Function of Angiotensin II in Skin Wound Healing Induction of Fibroblast and Keratinocyte Migration by Angiotensin II via Heparin-Binding Epidermal Growth Factor (EGF)-like Growth Factor-Mediated EGF Receptor Transactivation. The Journal of Biological Chemistry. 281 (19), 13209-13216 (2006).
- Trepat, X., Chen, Z., Jacobson, K. Cell Migration Single-Cell Migration. Comprehensive Physiology. 2 (4), (2012).
- Brand, S., et al. IL-22 is increased in active Crohn’s disease and promotes proinflammatory gene expression and intestinal epithelial cell migration. American Journal of Physiology: Gastrointestinal and Liver Physiology. 290, 827-838 (2006).
- Chi, Z., Melendez, A. J. Role of Cell Adhesion Molecules and Immune-Cell Migration in the Initiation, Onset and Development of Atherosclerosis. Cell Adhesion & Migration. 1 (4), 171-175 (2007).
- Chen, H., Nalbantoglu, J. Ring cell migration assay identifies distinct effects of extracellular matrix proteins on cancer cell migration. BMC Research Notes. 7 (183), 1-9 (2014).
- Stewart, J. A., Massey, E. P., Fix, C., Zhu, J., Goldsmith, E. C., Carver, W. Temporal alterations in cardiac fibroblast function following induction of pressure overload. Cell and tissue research. 340 (1), 117-126 (2010).
- Darby, I. A., Laverdet, B., Bonté, F., Desmoulière, A. Fibroblasts and myofibroblasts in wound healing. Clinical, Cosmetic and Investigational Dermatology. , 7 (2014).
- Kramer, N., et al. In vitro cell migration and invasion assays. Mutation Research – Reviews in Mutation Research. 752 (1), 10-24 (2013).
- Even-Ram, S., Yamada, K. M. Cell migration in 3D matrix. Current Opinion in Cell Biology. (17), 524-532 (2005).
- Valster, A., et al. Cell migration and invasion assays. Methods. 37, 208-215 (2005).
- Pijuan, J., et al. In vitro cell migration, invasion, and adhesion assays: From cell imaging to data analysis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 1-16 (2019).
- Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).
- Hulkower, K. I., Herber, R. L. Cell migration and invasion assays as tools for drug discovery. Pharmaceutics. 3 (1), 107-124 (2011).
- Walter, M. N. M., Wright, K. T., Fuller, H. R., MacNeil, S., Johnson, W. E. B. Mesenchymal stem cell-conditioned medium accelerates skin wound healing: An in vitro study of fibroblast and keratinocyte scratch assays. Experimental Cell Research. 316 (7), 1271-1281 (2010).
- Chaudhary, A., Bag, S., Barui, A., Banerjee, P., Chatterjee, J. Honey dilution impact on in vitro wound healing: Normoxic and hypoxic condition. Wound Repair and Regeneration. 23 (3), 412-422 (2015).
- Lipton, A., Klinger, I., Paul, D., Holleyt, R. W. Migration of Mouse 3T3 Fibroblasts in Response to a Serum Factor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 68 (11), (1971).
- Ascione, F., Guarino, A. M., Calabrò, V., Guido, S., Caserta, S. A novel approach to quantify the wound closure dynamic. Experimental Cell Research. (352), 175-183 (2017).
- Burr, S. D., Harmon, M. B., S, J. A. The Impact of Diabetic Conditions and AGE/RAGE Signaling on Cardiac Fibroblast Migration. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, (2020).
- Chang, S. S., Guo, W. H., Kim, Y., Wang, Y. L. Guidance of Cell Migration by Substrate Dimension. Biophysical Journal. 104, 313-321 (2013).
- Nguyen-Ngoc, K. V., et al. ECM microenvironment regulates collective migration and local dissemination in normal and malignant mammary epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (39), 2595-2604 (2012).
