コスト効率と適応性のあるスクラッチ移行アッセイ
Summary
また、機器を多用する方法を用いずに細胞移動を決定する新しい手法を提供する、スクラッチ移行アッセイにコスト効率の高い方法を提示します。線維芽細胞はこのプロトコルで使用されたが、それは適応され、細胞の移動に影響を追加の細胞タイプおよび影響を研究するために利用することができる。
Abstract
細胞の移動は、生理学的および病理学的事象の両方において重要な要素である。正常な細胞移動は、免疫応答の開発や取り付けなどの重要な機能に必要です。細胞の移動過程で欠損または変化が起こると、有害な結果(すなわち、癌転移、創傷治癒、瘢痕形成)を有する可能性がある。細胞移動の重要性のために、手頃な価格、適応性、反復可能な細胞移動アッセイへのアクセスが必要です。一般的なスクラッチ移行アッセイを利用して、一般的な実験室機器を用いた細胞移動解析の新しい手法を開発しました。説明された方法は、タイムラプス顕微鏡を使用せずに関心のある特定の領域を再キャプチャすることを可能にする視覚的なマーカーを使用しています。さらに、移行マトリックス基質の変更から薬理学的修飾剤の添加に至るまで、実験計画において柔軟性を提供します。さらに、このプロトコルは、細胞の移動を調べる際にいくつかの方法では考慮されない、細胞の移動の領域を説明する方法を概説します。この新しいアプローチは、より多くの聴衆にスクラッチ移行アッセイを提供し、研究者が細胞移動の生理学的および病理生理学的影響を調べるより大きな機会を提供する。
Introduction
細胞の移動は、多くの生理学的事象および病理学的事象にとって極めて重要である。それは、開発中に、免疫応答を取り付けるために、および適切な創傷治癒1、2、3のために必要とされる。これらの細胞移動イベントの多くは、物理的または化学的な信号によって引き起こされる可能性があります。例えば、免疫応答中に、白血球は化学誘引剤2に応答して傷害部位に向かって移行する。さらに、白血球はまた、追加の免疫細胞の移動を誘導するためにサイトカインを放出し、ならびに創傷治癒過程に関与する線維芽細胞などの他の細胞タイプ、およびしたがって、多細胞応答4を始動する。細胞の移行能力は、適切な生理機能のために不可欠です。しかし、細胞の移動が未チェックになると、それは有害な反応を有し、慢性炎症、血管疾患、癌転移、および傷害治癒障害2、3、4、5、6、7などの病理学的事象に寄与する可能性がある。傷の治癒障害は、細胞移動の欠陥による糖尿病患者の一般的な苦痛であり、これらの欠陥に対処しなければ、さらなる合併症(例えば、切断8、9)につながる可能性がある。この研究は、他の研究と同様に、正常な生理学的または病理学的状態下で細胞移動が起こるプロセスをさらに理解する必要性を示しており、この研究分野を進めるために不可欠である。これを達成するためには、これらのアッセイを行うために必要な機器を持っていない可能性のある研究者がアクセス可能で手頃な価格の移行アッセイを利用する必要があります。
現在、細胞移動に関する幅広いトピックを検討するために利用可能な様々な移行アッセイがあります。2D と 3D の両方の移行モデルが開発されており、それぞれがセル移行に影響を与える特定の領域を対象としています。3D移行モデルは、通常、細胞浸潤研究に関連しており、細胞外マトリックスが細胞移動に及ぼす影響を評価する10,11,12であり、2D移行アッセイは応用範囲が広く、主に細胞移動中の化学学的移動、創傷治癒、および機能的変化を研究するために使用される13、14、15、16。これらのアッセイのいくつかは、特定の研究者にこれらのアッセイの可用性を減らすことができるボイデンチャンバーや除外リングなどの追加の機器を必要とします。よりコスト効率の高いアッセイの1つは、創傷治癒および細胞移動14,17における一般的な変化を評価するために典型的に使用されるスクラッチアッセイである。ほとんどの研究所はスクラッチアッセイを実施するために装備されていますが、細胞の移動を追跡するために使用される機器は、利用できないか、購入するには高価すぎる傾向があります。これには、逆顕微鏡とライブイメージングシステムを必要とするタイムラプス顕微鏡が含まれます。これらの高価な機器は、すべての実験室に一般的にアクセスできるわけではありません。したがって、この観察は、より容易に入手可能な機器で細胞移動の評価を可能にする新しいプロトコルの必要性を強調する。
ここで示すプロトコルは、セルの移行を評価する新しい手頃な方法を提供します。この方法は、スクラッチアッセイに関連する同じ手順に従いますが、基礎科学の実験室で一般的に入手可能な機器を利用して細胞移動を調べる分析において異なります。共通の装置を使用するこのプロトコルはタイムラプス顕微鏡法を使用しないで細胞の移動のより正確な決定を可能にする。この方法は、移行の決定に加えて、セルの移行に大きな影響を与えるスクラッチ領域の可変要因も考慮します。全体として、細胞移動解析のためのこの新しいプロトコルは、より多くの研究室が細胞移動の分野を探索し、貢献する機会を提供します。
Protocol
Representative Results
Discussion
スクラッチ移行アッセイに対するこの新しいアプローチは、研究者が細胞移動の変化を調べるためのよりアクセスしやすい方法を提供します。このアッセイは、他のスクラッチアッセイと同様のスクラッチを投与するための同じ手順に従うが、細胞移動10のイメージングおよび正確な分析のための新しい方法を提供する。この方法は、タイムラプス顕微鏡とライブセルイメ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、米国陸軍医学研究賞#81XWH-16-1-0710、ミシシッピ大学薬学部、生体分子科学科によって支援されています。
Materials
| Adobe All Apps | Adobe | This includes Adobe photoshop which is the imaging software used with this protocol | |
| Avant Pipette Tips 200ul Binding non-sterile | MIDSCI | AVR1 | Tips are autoclaved to sterilize |
| AxioCam Erc 5s Camera | Zeiss | 426540-9901-000 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Fisher Scientific | BP101-25 | |
| Costar Flat Bottom Cell Culture Plates 48 Wells | Fisher Scientific | 07-200-86 | |
| DMEM with L-Glutamine, 1g/L glucose and sodium pyruvate | Fisher Scientific | MT10014CM | |
| Image J | NIH | This is a free software offered by the US government and is the analysis software used with this protocol | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | AC416785000 | |
| Premium US origin fetal bovine serum | Innovative Research | IFBS-HU | |
| Primocin | InvivoGEN | ant-pm-2 | This is the anitmicrobial used for with this procotol to culture cardiac fibroblasts |
| Zeiss Primovert Microscope | Zeiss | 491206-0002-000 | |
| Zen Blue Edition 2.3 software | Zeiss | software comes with camera purchase |
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