비용 효과적이고 적응 가능한 스크래치 마이그레이션 분석
Summary
당사는 장비 집약적 방법을 사용하지 않고 세포 마이그레이션을 결정하는 새로운 접근 방식을 제공하는 스크래치 마이그레이션 분석법에 비용 효율적인 방법을 제시합니다. 섬유아세포가 이 프로토콜에 사용되었지만, 세포 이동에 대한 추가 세포 유형과 영향을 연구하기 위해 적응하고 활용할 수 있습니다.
Abstract
세포 이동은 생리학적 및 병리학 적 사건의 핵심 구성 요소입니다. 면역 반응의 발달 및 장착과 같은 필수 기능에 는 정상적인 세포 이동이 필요합니다. 세포 이동 프로세스에 결함이나 변경이 발생하면 해로운 결과(즉, 암 전이, 상처 치유 및 흉터 형성)가 발생할 수 있습니다. 세포 마이그레이션의 중요성때문에, 저렴하고 적응가능하며 반복가능한 세포 마이그레이션 분석서에 접근할 필요가 있습니다. 일반적인 스크래치 마이그레이션 분석을 활용하여 일반 실험실 장비를 사용하는 세포 마이그레이션을 분석하는 새로운 접근 방식을 개발했습니다. 설명된 방법은 시간 경과 현미경 검사를 사용하지 않고 관심있는 특정 영역을 다시 캡처 할 수있는 시각적 마커를 사용합니다. 또한, 이동 매트릭스 기판 변경에서 약리학적 수정제의 첨가에 이르기까지 실험 설계의 유연성을 제공한다. 또한 이 프로토콜은 셀 마이그레이션을 검사할 때 여러 가지 방법으로 간주되지 않는 셀 마이그레이션 영역을 설명하는 방법을 간략하게 설명합니다. 이 새로운 접근은 더 큰 청중에게 스크래치 이주 분석법을 제공하고 연구원이 세포 이동의 생리적 및 병리학적 영향을 검토 할 수있는 더 큰 기회를 제공 할 것입니다.
Introduction
세포 이동은 많은 생리학적 뿐만 아니라 병리학적 사건에 매우 중요합니다. 개발 중, 면역 반응을 장착하고, 적절한 상처 치유1,2,3이필요합니다. 이러한 세포 마이그레이션 이벤트의 대부분은 물리적 또는 화학적 신호에 의해 트리거될 수 있습니다. 예를 들어, 면역 반응 중에 백혈구는 화학 요법2에대응하여 부상 부위로 이동합니다. 또한, 백혈구는 또한 상처 치유 과정에 관여하는 섬유아세포와 같은 다른 세포 유형뿐만 아니라 추가 면역 세포의 이동을 유도하기 위해 사이토카인을 방출하여 다세포 반응4를시작한다. 이동하는 세포의 능력은 적절한 생리적 기능에 필수적입니다. 그러나, 세포 이동이 확인되지 않을 때, 그것은 불리한 반응을 가질 수 있고 만성 염증, 혈관 질환, 암 전이 및손상된 상처 치유2,3,4,5,6,7과같은 병리학적 사건에 기여할 수 있다. 손상된 상처 치유는 세포 이동의 결함으로 인한 당뇨병 환자의 일반적인 고난이며, 이러한 결함이 해결되지 않으면 추가 합병증(예: 절단8,9)으로이어질 수 있습니다. 이 연구 결과는, 그 외, 세포 이주가 일어나는 과정을 추가로 이해하는 필요성을 표시했습니다, 일반적인 생리학 또는 병리학적인 조건의 밑에, 그리고 연구의 이 필드를 발전시키기위한 것이 중요합니다. 이를 달성하기 위해서는 이러한 조사를 수행하는 데 필요한 장비를 소지하지 않을 수 있는 연구자들에게 접근 가능하고 저렴한 마이그레이션 에세이가 있어야 합니다.
현재 셀 마이그레이션과 관련된 다양한 주제를 검사할 수 있는 다양한 마이그레이션 에세이가 있습니다. 각각 셀 마이그레이션에 영향을 미치는 특정 영역을 대상으로 2D 및 3D 마이그레이션 모델이 모두 개발되었습니다. 3D 마이그레이션 모델은 전형적으로 세포 침입 연구와 연관되고 세포 이동10,11,12에세포 외 매트릭스의 영향을 평가하는 반면, 2D 마이그레이션 소는 적용 범위가 크고 주로 세포 마이그레이션13,14, 15,16동안 화학 작용, 상처 치유 및 기능적 변화를 연구하는 데 사용된다. 이러한 소의 몇몇은 특정 연구원에게 이 사실의 가용성을 감소시킬 수 있는 보이든 챔버 또는 배제 반지와 같은 추가 장비가 필요합니다. 보다 비용 효율적인 분석 방법 중 하나는 일반적으로 상처 치유 및 세포 마이그레이션14,17의일반적인 변화를 평가하는 데 사용되는 스크래치 분석이다. 대부분의 실험실은 스크래치 분석기를 수행하도록 장착되어 있지만 셀 마이그레이션을 추적하는 데 사용되는 장비는 사용할 수 없거나 구매비용이 너무 많이 드는 경향이 있습니다. 이것은 반전된 현미경 및 살아있는 화상 진찰 시스템을 요구하는 시간 경과 현미경 검사를 포함합니다. 이러한 고가의 장비는 모든 실험실에서 일반적으로 접근할 수 없습니다. 따라서 이 관찰은 보다 쉽게 사용할 수 있는 장비로 세포 마이그레이션을 평가할 수 있는 새로운 프로토콜의 필요성을 강조합니다.
여기에 제시된 프로토콜은 세포 마이그레이션을 평가하는 새롭고 저렴한 방법을 제공합니다. 이 방법은 스크래치 분석과 관련된 동일한 절차를 따르지만 기본 과학 실험실 환경에서 더 일반적으로 사용할 수있는 장비를 활용하여 세포 이동을 검사하는 분석에서 다릅니다. 일반적인 장비를 사용하는 이 프로토콜은 시간 경과 현미경 검사를 사용하지 않고도 세포 이동을 보다 정확하게 판단할 수 있습니다. 마이그레이션을 결정하는 것 외에도 이 메서드는 셀 마이그레이션에 큰 영향을 미치는 것으로 지적된 스크래치 영역의 가변 요인을 고려합니다. 전반적으로, 세포 마이그레이션 분석을 위한 이 새로운 프로토콜은 더 많은 실험실이 세포 마이그레이션 분야에 탐구하고 기여할 수 있는 기회를 제공합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
스크래치 마이그레이션 분석법에 대한 이 새로운 접근 법은 연구원이 세포 마이그레이션의 변화를 검사하는 데 보다 접근 가능한 방법을 제공합니다. 이 분석은 다른 스크래치 분석법과 유사한 스크래치를 투여하기 위한 동일한 절차를 따르지만, 세포이동(10)의이미징 및 정확한 분석을 위한 새로운 방법을 제공한다. 이 방법은 장비 집약적인 시간 경과 현미경 검사법과 라이브 …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 미국 육군 의학 연구 상 #81XWH-16-1-0710, 미시시피 대학 약국 및 생물 분자 과학부에 의해 지원됩니다.
Materials
| Adobe All Apps | Adobe | This includes Adobe photoshop which is the imaging software used with this protocol | |
| Avant Pipette Tips 200ul Binding non-sterile | MIDSCI | AVR1 | Tips are autoclaved to sterilize |
| AxioCam Erc 5s Camera | Zeiss | 426540-9901-000 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Fisher Scientific | BP101-25 | |
| Costar Flat Bottom Cell Culture Plates 48 Wells | Fisher Scientific | 07-200-86 | |
| DMEM with L-Glutamine, 1g/L glucose and sodium pyruvate | Fisher Scientific | MT10014CM | |
| Image J | NIH | This is a free software offered by the US government and is the analysis software used with this protocol | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | AC416785000 | |
| Premium US origin fetal bovine serum | Innovative Research | IFBS-HU | |
| Primocin | InvivoGEN | ant-pm-2 | This is the anitmicrobial used for with this procotol to culture cardiac fibroblasts |
| Zeiss Primovert Microscope | Zeiss | 491206-0002-000 | |
| Zen Blue Edition 2.3 software | Zeiss | software comes with camera purchase |
References
- Gilbert, S. F. . Developmental biology. , (1997).
- Luster, A. D., Alon, R., Von Andrian, U. H. Immune cell migration in inflammation: present and future therapeutic targets. Nature Immunology. 6, (2005).
- Yahata, Y., et al. A Novel Function of Angiotensin II in Skin Wound Healing Induction of Fibroblast and Keratinocyte Migration by Angiotensin II via Heparin-Binding Epidermal Growth Factor (EGF)-like Growth Factor-Mediated EGF Receptor Transactivation. The Journal of Biological Chemistry. 281 (19), 13209-13216 (2006).
- Trepat, X., Chen, Z., Jacobson, K. Cell Migration Single-Cell Migration. Comprehensive Physiology. 2 (4), (2012).
- Brand, S., et al. IL-22 is increased in active Crohn’s disease and promotes proinflammatory gene expression and intestinal epithelial cell migration. American Journal of Physiology: Gastrointestinal and Liver Physiology. 290, 827-838 (2006).
- Chi, Z., Melendez, A. J. Role of Cell Adhesion Molecules and Immune-Cell Migration in the Initiation, Onset and Development of Atherosclerosis. Cell Adhesion & Migration. 1 (4), 171-175 (2007).
- Chen, H., Nalbantoglu, J. Ring cell migration assay identifies distinct effects of extracellular matrix proteins on cancer cell migration. BMC Research Notes. 7 (183), 1-9 (2014).
- Stewart, J. A., Massey, E. P., Fix, C., Zhu, J., Goldsmith, E. C., Carver, W. Temporal alterations in cardiac fibroblast function following induction of pressure overload. Cell and tissue research. 340 (1), 117-126 (2010).
- Darby, I. A., Laverdet, B., Bonté, F., Desmoulière, A. Fibroblasts and myofibroblasts in wound healing. Clinical, Cosmetic and Investigational Dermatology. , 7 (2014).
- Kramer, N., et al. In vitro cell migration and invasion assays. Mutation Research – Reviews in Mutation Research. 752 (1), 10-24 (2013).
- Even-Ram, S., Yamada, K. M. Cell migration in 3D matrix. Current Opinion in Cell Biology. (17), 524-532 (2005).
- Valster, A., et al. Cell migration and invasion assays. Methods. 37, 208-215 (2005).
- Pijuan, J., et al. In vitro cell migration, invasion, and adhesion assays: From cell imaging to data analysis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 1-16 (2019).
- Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).
- Hulkower, K. I., Herber, R. L. Cell migration and invasion assays as tools for drug discovery. Pharmaceutics. 3 (1), 107-124 (2011).
- Walter, M. N. M., Wright, K. T., Fuller, H. R., MacNeil, S., Johnson, W. E. B. Mesenchymal stem cell-conditioned medium accelerates skin wound healing: An in vitro study of fibroblast and keratinocyte scratch assays. Experimental Cell Research. 316 (7), 1271-1281 (2010).
- Chaudhary, A., Bag, S., Barui, A., Banerjee, P., Chatterjee, J. Honey dilution impact on in vitro wound healing: Normoxic and hypoxic condition. Wound Repair and Regeneration. 23 (3), 412-422 (2015).
- Lipton, A., Klinger, I., Paul, D., Holleyt, R. W. Migration of Mouse 3T3 Fibroblasts in Response to a Serum Factor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 68 (11), (1971).
- Ascione, F., Guarino, A. M., Calabrò, V., Guido, S., Caserta, S. A novel approach to quantify the wound closure dynamic. Experimental Cell Research. (352), 175-183 (2017).
- Burr, S. D., Harmon, M. B., S, J. A. The Impact of Diabetic Conditions and AGE/RAGE Signaling on Cardiac Fibroblast Migration. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, (2020).
- Chang, S. S., Guo, W. H., Kim, Y., Wang, Y. L. Guidance of Cell Migration by Substrate Dimension. Biophysical Journal. 104, 313-321 (2013).
- Nguyen-Ngoc, K. V., et al. ECM microenvironment regulates collective migration and local dissemination in normal and malignant mammary epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (39), 2595-2604 (2012).
