En kostnadseffektiv och anpassningsbar Scratch Migration Assay
Summary
Vi presenterar en kostnadseffektiv metod för att scratch migration analys som ger en ny metod för att fastställa cell migration utan användning av utrustning-intensiva metoder. Medan fibroblaster användes i detta protokoll, det kan anpassas och utnyttjas för att studera ytterligare celltyper och influenser på cell migration.
Abstract
Cellmigration är en nyckelkomponent i både fysiologiska och patologiska händelser. Normal cellmigration krävs för viktiga funktioner som utveckling och montering av ett immunsvar. När en defekt eller förändring inträffar med cellmigrationsprocessen, det kan ha skadliga resultat (dvs. cancer metastasering, sårläkning, och ärrbildning). På grund av vikten av cellmigration är det nödvändigt att ha tillgång till en cell migration assay som är prisvärd, anpassningsbar, och repeterbara. Utnyttja den gemensamma rep migration analys, har vi utvecklat en ny metod för att analysera cell migration som använder allmän laboratorieutrustning. Metoden som beskrivs använder visuella markörer som möjliggör återerövring av specifika områden av intresse utan användning av time-lapse mikroskopi. Dessutom ger det flexibilitet i den experimentella designen, allt från att förändra underlaget migrationsmatris till tillsats av farmakologiska modifierare. Vidare skisserar detta protokoll ett sätt att redogöra för området för cellmigration, vilket inte anses med flera metoder när man undersöker cellmigration. Denna nya metod erbjuder en skrapmigration analys till en större publik och kommer att ge större möjligheter för forskare att undersöka fysiologiska och patofysiologiska effekterna av cellmigration.
Introduction
Cellmigration är avgörande för många fysiologiska såväl som patologiska händelser. Det krävs under utveckling, för montering av ett immunsvar, och för korrekt sårläkning1,2,3. Många av dessa cellmigreringshändelser kan utlösas av fysiska eller kemiska signaler. Till exempel, under ett immunsvar, leukocyter kommer att migrera mot en plats för skada som svar på en chemoattractant2. Dessutom kommer leukocyter också släppa cytokiner att inducera migration av ytterligare immunceller, liksom andra celltyper, såsom fibroblaster, som är involverade i sårläkningsprocessen, och därmed, initiera en flercellig svar4. Cellernas förmåga att migrera är avgörande för korrekt fysiologisk funktion; emellertid, när cell migration går okontrollerat, det kan ha en negativ respons och bidra till patologiska händelser, såsom kronisk inflammation, kärlsjukdom, cancer metastasering, och nedsatt sårläkning2,3,4,5,6,7. Nedsatt sårläkning är en vanlig åkomma av diabetiker på grund av defekter i cellmigration, och om dessa defekter inte åtgärdas, kan det leda till ytterligare komplikationer (t.ex. amputation8,9). Denna studie, liksom andra, har visat på behovet av att ytterligare förstå den process genom vilken cellmigration sker, antingen under normala fysiologiska eller patologiska förhållanden, och det är avgörande för att främja detta forskningsområde. För att åstadkomma detta, det måste finnas migration analyser tillgängliga som är både tillgängliga och överkomliga för de forskare, som kanske inte har den utrustning som behövs för att genomföra dessa analyser.
För närvarande finns det en mängd olika migrationsanalyser tillgängliga för att undersöka ett brett spektrum av ämnen när det gäller cellmigration. Både 2D och 3D-migreringsmodeller har utvecklats, var och en som riktar sig till specifika områden som påverkar cellmigrationen. 3D-migreringsmodeller är vanligtvis förknippade med cellinvasionstudier och bedömer effekten av extracellulär matris på cellmigration10,11,12, medan 2D-flyttningsanalyser har ett större användningsområde och används främst för att studera chemotaktisk migration, sårläkning och funktionella förändringar under cellmigration13,14,15,16. Flera av dessa analyser kräver ytterligare utrustning, såsom Boyden kammare eller uteslutning ringar, vilket kan minska tillgången på dessa analyser till vissa forskare. En av de mer kostnadseffektiva analyserna är skraplotterna, som vanligtvis används för att bedöma sårläkning och allmänna förändringar i cellmigration14,17. Medan de flesta laboratorier är utrustade för att genomföra en repastäs, den utrustning som används för att spåra cell migration tenderar att antingen vara otillgänglig eller för dyrt att köpa. Detta inkluderar timelapsemikroskopi, som kräver ett inverterat mikroskop och ett livebildsystem. Dessa dyra delar av utrustning är inte allmänt tillgängliga för alla laboratorium. Därför belyser denna observation behovet av ett nytt protokoll som möjliggör bedömning av cellmigration med mer lättillgänglig utrustning.
Det protokoll som presenteras här ger ett nytt och prisvärt sätt att bedöma cellmigration. Denna metod följer samma förfarande i samband med scratch analyser men skiljer sig i analysen av att undersöka cell migration genom att utnyttja utrustning mer allmänt tillgängliga i en grundläggande vetenskaper laboratorieinställning. Detta protokoll med hjälp av gemensam utrustning möjliggör en mer exakt bestämning av cellmigration utan användning av time-lapse mikroskopi. Förutom att fastställa migration, denna metod står också för variabla faktorer i scratch området som har noterats för att kraftigt påverka cell migration. Sammantaget ger detta nya protokoll för cellmigrationsanalys en möjlighet för fler laboratorier att utforska och bidra till området cellmigration.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denna nya metod för repmigreringsanalys ger en mer tillgänglig metod för forskare att undersöka förändringar i cellmigrationen. Medan denna analys följer samma förfarande för att administrera en repa som liknar andra repastanalyser, det ger en ny metod för bildbehandling och korrekt analys av cell migration10. Istället för att använda utrustning-intensiva metoder för time-lapse mikroskopi och levande cell bildbehandling kammare, denna metod detaljer användningen av allmänt tillgän…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av US Army Medical Research Award #81XWH-16-1-0710, University of Mississippi School of Pharmacy och Institutionen för biomolekylära vetenskaper.
Materials
| Adobe All Apps | Adobe | This includes Adobe photoshop which is the imaging software used with this protocol | |
| Avant Pipette Tips 200ul Binding non-sterile | MIDSCI | AVR1 | Tips are autoclaved to sterilize |
| AxioCam Erc 5s Camera | Zeiss | 426540-9901-000 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Fisher Scientific | BP101-25 | |
| Costar Flat Bottom Cell Culture Plates 48 Wells | Fisher Scientific | 07-200-86 | |
| DMEM with L-Glutamine, 1g/L glucose and sodium pyruvate | Fisher Scientific | MT10014CM | |
| Image J | NIH | This is a free software offered by the US government and is the analysis software used with this protocol | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | AC416785000 | |
| Premium US origin fetal bovine serum | Innovative Research | IFBS-HU | |
| Primocin | InvivoGEN | ant-pm-2 | This is the anitmicrobial used for with this procotol to culture cardiac fibroblasts |
| Zeiss Primovert Microscope | Zeiss | 491206-0002-000 | |
| Zen Blue Edition 2.3 software | Zeiss | software comes with camera purchase |
References
- Gilbert, S. F. . Developmental biology. , (1997).
- Luster, A. D., Alon, R., Von Andrian, U. H. Immune cell migration in inflammation: present and future therapeutic targets. Nature Immunology. 6, (2005).
- Yahata, Y., et al. A Novel Function of Angiotensin II in Skin Wound Healing Induction of Fibroblast and Keratinocyte Migration by Angiotensin II via Heparin-Binding Epidermal Growth Factor (EGF)-like Growth Factor-Mediated EGF Receptor Transactivation. The Journal of Biological Chemistry. 281 (19), 13209-13216 (2006).
- Trepat, X., Chen, Z., Jacobson, K. Cell Migration Single-Cell Migration. Comprehensive Physiology. 2 (4), (2012).
- Brand, S., et al. IL-22 is increased in active Crohn’s disease and promotes proinflammatory gene expression and intestinal epithelial cell migration. American Journal of Physiology: Gastrointestinal and Liver Physiology. 290, 827-838 (2006).
- Chi, Z., Melendez, A. J. Role of Cell Adhesion Molecules and Immune-Cell Migration in the Initiation, Onset and Development of Atherosclerosis. Cell Adhesion & Migration. 1 (4), 171-175 (2007).
- Chen, H., Nalbantoglu, J. Ring cell migration assay identifies distinct effects of extracellular matrix proteins on cancer cell migration. BMC Research Notes. 7 (183), 1-9 (2014).
- Stewart, J. A., Massey, E. P., Fix, C., Zhu, J., Goldsmith, E. C., Carver, W. Temporal alterations in cardiac fibroblast function following induction of pressure overload. Cell and tissue research. 340 (1), 117-126 (2010).
- Darby, I. A., Laverdet, B., Bonté, F., Desmoulière, A. Fibroblasts and myofibroblasts in wound healing. Clinical, Cosmetic and Investigational Dermatology. , 7 (2014).
- Kramer, N., et al. In vitro cell migration and invasion assays. Mutation Research – Reviews in Mutation Research. 752 (1), 10-24 (2013).
- Even-Ram, S., Yamada, K. M. Cell migration in 3D matrix. Current Opinion in Cell Biology. (17), 524-532 (2005).
- Valster, A., et al. Cell migration and invasion assays. Methods. 37, 208-215 (2005).
- Pijuan, J., et al. In vitro cell migration, invasion, and adhesion assays: From cell imaging to data analysis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 1-16 (2019).
- Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).
- Hulkower, K. I., Herber, R. L. Cell migration and invasion assays as tools for drug discovery. Pharmaceutics. 3 (1), 107-124 (2011).
- Walter, M. N. M., Wright, K. T., Fuller, H. R., MacNeil, S., Johnson, W. E. B. Mesenchymal stem cell-conditioned medium accelerates skin wound healing: An in vitro study of fibroblast and keratinocyte scratch assays. Experimental Cell Research. 316 (7), 1271-1281 (2010).
- Chaudhary, A., Bag, S., Barui, A., Banerjee, P., Chatterjee, J. Honey dilution impact on in vitro wound healing: Normoxic and hypoxic condition. Wound Repair and Regeneration. 23 (3), 412-422 (2015).
- Lipton, A., Klinger, I., Paul, D., Holleyt, R. W. Migration of Mouse 3T3 Fibroblasts in Response to a Serum Factor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 68 (11), (1971).
- Ascione, F., Guarino, A. M., Calabrò, V., Guido, S., Caserta, S. A novel approach to quantify the wound closure dynamic. Experimental Cell Research. (352), 175-183 (2017).
- Burr, S. D., Harmon, M. B., S, J. A. The Impact of Diabetic Conditions and AGE/RAGE Signaling on Cardiac Fibroblast Migration. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, (2020).
- Chang, S. S., Guo, W. H., Kim, Y., Wang, Y. L. Guidance of Cell Migration by Substrate Dimension. Biophysical Journal. 104, 313-321 (2013).
- Nguyen-Ngoc, K. V., et al. ECM microenvironment regulates collective migration and local dissemination in normal and malignant mammary epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (39), 2595-2604 (2012).
