מודלים של בעלי חיים לדלקת לבלב חריפה חמורה מאפשרים לחקור שינויים פתופיציולוגיים בשלב הראשוני, ומאפשרים התבוננות בהתפתחות של אירועים דלקתיים. כאן אנו מספקים פרוטוקול עבור אינדוקציה של דלקת לבלב מרה חריפה חמורה על ידי עירוי מדרדר של נתרן taurocholate לתוך צינור הלבלב של עכברי C57BL/6 מרדים.
אינדוקציה דלקת לבלב חריפה מרה על ידי עירוי נתרן taurocholate כבר בשימוש נרחב על ידי הקהילה המדעית בשל ייצוג של המצב הקליני האנושי רבייה של אירועים דלקתיים המתאימים לתחלת דלקת הלבלב המרה קלינית. ניתן להעריך את חומרת הנזק בלבלב על ידי מדידת הריכוז, המהירות והנפח של חומצת המרה המושרשת. מחקר זה מספק רשימת פעולות לביצוע מעודכנת של החומרים והשיטות המשמשים ברביית הפרוטוקול ומראה את התוצאות העיקריות ממודל דלקת הלבלב החריפה (AP). רוב הפרסומים הקודמים הגבילו את עצמם לשחזור מודל זה בחולדות. יישמנו שיטה זו בעכברים, המספקת יתרונות נוספים (כלומר, הזמינות של ארסנל של ריאגנטים ונוגדנים עבור בעלי חיים אלה יחד עם האפשרות לעבוד עם זנים מהונדסים גנטית של עכברים) שעשויים להיות רלוונטיים למחקר. עבור אינדוקציה דלקת לבלב חריפה בעכברים, אנו מציגים פרוטוקול שיטתי, עם מנה מוגדרת של 2.5% נתרן taurocholate במהירות עירוי 10 μL / min במשך 3 דקות C57BL / 6 עכברים שמגיע לרמה המקסימלית של חומרה בתוך 12 שעות של אינדוקציה ולהדגיש תוצאות עם תוצאות המאמתות את השיטה. עם תרגול וטכניקה, הזמן המשוער הכולל, מן האינדוקציה של הרדמה עד השלמת עירוי, הוא 25 דקות לכל חיה.
אצל בני אדם, נוכחות של אבני מרה היא הגורם הנפוץ ביותר לדלקת הלבלב עקב חסימת החלק הסופי של choledochal, הפרעה לזרימה של הפרשות הלבלב וגרימת תהליך דלקתי אינטנסיבי בלבלב, עם עלייה בריכוז אנזימי העיכול בסרום ומתווכים דלקתיים1,2.
שתי תיאוריות שונות הוצעו כדי להסביר את ההתפתחות של דלקת לבלב חריפה (AP). תיאוריית “הערוץ המשותף” מציעה כי האבנים הנמצאות בכיס המרה חוסמות את מערכת צינור המרה הנפוצה הדיסטלית, ומאפשרות להפרשת מרה לזרום מדרדרות לתוך צינור הלבלב. התיאוריה השנייה (תיאוריית “חסימת צינור”) מציעה כי חסימת צינור הלבלב על ידי אבני מרה עודפות גורמת לחסימה בזרימת הפרשת הלבלב לתריסריון, וגורמת ליתר לחץ דם דביק3. למרות המנגנונים המובילים דלקת לבלב מרה חריפה אינם מובנים במלואם, התוצאה היא תהליך דלקתי אינטנסיבי. התפרצות אנזימי עיכול ועיכול עצמי בלבלב מובילים לשינויים היסטופתולוגיים, לעלייה בציטוקינים דלקתיים (IL-1β, IL-6, TNF-α) בנוזל אסיטי ובנסיוב, ולעלייה בחלבוני פאזה חריפים4,5,6.
דלקת לבלב חריפה חמורה היא מצב שראוי לתשומת לב קלינית בשל מעורבות של איברים מרובים וסיכון תמותה גבוה. מודלים בעלי חיים להתרבות של דלקת לבלב חריפה (AP) חשובים כמו אלה להסביר את המנגנונים הפתופיזיולוגיים של המחלה ולעזור ניטור האבולוציה של אירועים דלקתיים, החל מהשלבים הראשונים של המחלה. זה בדרך כלל לא אפשרי במרפאות2,7. בנוסף, גישה לרקמות הלבלב קלה במחקרים פרה-קליניים, לטובת ההבהרה של שינויים הקשורים לתנאים קליניים8 יחד עם האפשרות לעבוד עם מינים איזוגניים, ביטול משתנים לא רצויים, ושיקוף דמיון קליני עם התוצאות שנצפו במצב האנושי9.
מודלים מרה ולא מרה עבור אינדוקציה של דלקת לבלב חריפה בחולדות ומינים של עכברים נחקרו לעתים קרובות בספרות המדעית. שיטות אינדוקציה שאינן מרה כוללות מתן מינונים מגרה סופרמקימליים של סודהוג cholecystokinin או cerulein אנלוגי שלה10; ניהול של מינונים כמעט קטלניים של L-ארגנין; או ניהול של דיאטה כולין לקוי בתוספת אתionine11. למרות שיטות אלה קל להתרבות ולגרום דלקת הלבלב, הם אינם לשכפל את המנגנונים כי בתיאוריה לעורר AP (כלומר, ריפלוקס של הפרשת מרה לתוך צינור הלבלב). הטכניקה המטפלת במודל המרה מבוססת על עירוי מדרדר של חומצות מרה לתוך צינור הלבלב ודורש חוקרים מאומנים היטב לבצע פרוטוקול זה. מספר מחקרים פורסמו בשיטה זו בחולדות (ככל הנראה מסיבות טכניות מאז ניסויים אלה כרוכים בהליכים כירורגיים)12,13. עם זאת, הגישה בעכברים עשויה להציע תוצאות מעניינות יותר בחקר דלקת3,14,15. במחקר זה, אנו מראים רשימה של השלבים שיש לעקוב אחר להתרבות של דלקת לבלב חריפה חמורה על ידי עירוי של נתרן taurocholate ב C57BL / 6 עכברים מרדים.
עבור עבודות הכרוכות בצורך בניסויים בנוגדנים וניתוח של ביטוי הגן והחלבון, השימוש בעכברים עדיף בגלל הארסנל הגדול יותר של חומרים עבור בעלי חיים אלה והאפשרות לעבוד עם מינים איזוגניים ונוקאאוט, בין היתר שניתן להשתמש בהם רלוונטיים למחקרים16. עכברים C57BL/6 הוא זן לידה של עכברים שפותח במקור לחקר פעילות אנטי-טמור ואימונולוגיה. זן זה מועדף יותר ויותר על ידי החוקרים על היותו איזוגני, ומאפשר רבייה גדולה יותר של תוצאות, אשר עשוי לרמוז על שימוש במספר קטן יותר של בעלי חיים בניסוי ופחות שונות של תוצאות בין אותה קבוצה17,18.
Perides et al. (2010)14 פרסם פרוטוקול עבור אינדוקציה AP בעכברים על ידי עירוי נתרן taurocholate. כאן אנו מעדכנים את המודל הזה בריכוז נתרן טאורוכולאט גבוה יותר (2.5%) בעכברים C57BL/6, עם נפח ומהירות מוגדרים של עירוי (איור 1). הרמה המקסימלית של חומרה מגיעה בתוך 12 שעות של אינדוקציה בעכברים. העלאת הריכוז של IL-6 הן בסרום והן בחלל הצפק מתואמת עם ההתקדמות של AP. עם תרגול, הזמן המשוער הכולל מן אינדוקציה של הרדמה עד השלמת עירוי, הוא 25 דקות לכל חיה. זה חיוני כי חוקר מיומן מבצע את הניסוי הזה. כדי להבטיח כי הפתרון מוזרק כראוי לתוך צינור המרה המשותף, לבצע מספר אימונים פיילוט באמצעות מתילן כחול במקום נתרן taurocholate.
השיטה של גרימת דלקת לבלב חריפה על ידי עירוי נתרן taurocholate מדרדר כבר הוצג חולדות22,23,24. שלוש יצירות דומות, שפורסמו בשנים 2008, 2010 ו-2015, שימשו התייחסות לפרוטוקול3,14,15. בעבודה זו, אנו מפרטים את כל הש…
The authors have nothing to disclose.
המחברים הודות לתוכנית לאחר סיום הלימודים במרפאה של אוניברסיטת סאו פאולו; Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) ואוניברסיטת סאו פאולו בית הספר לרפואה (FMUSP).
0.4 mm needle | INTRAG MEDICAL TECH | 90183210 | 30G |
0.54 mm polyethylene tube | Tygon | 730010 | – |
Styrofoam block | – | – | – |
masking tape for mounting the mouse | Missner | 1236 | – |
Infusion pump scheduled to 10µL / min. | Havard aparatus-Peristaltic Pump Series | MA1 55-7766 | Model 66 Small Peristaltic |
Scissors and forceps | |||
Antiseptic providine iodine | Pfizer | 12086OR | antisepsis |
70% ethanol | SIGMA | 459836 | Mix 700 mL 100% ethanol with 300 mL dH2O |
Razor blade | Lord | bdk9a1ghk6 | For trichotomy |
Sodium taurocholate | Sigma-Aldrich | 86339- 1G | CAS NUMBER- 345909-26-4 |
microvessel clip | Medicon Surgical | 56.87.35 | Approximator, opening 4.0 mm, closing pressure 30 - 40 g |
6-0 prolene | Bioline | 5162 | Suture line |
Ketamin NP (cloridrato de dextrocetamina) 50mg/mL | Cristália | ||
Xilazine 2% | Syntec | ||
Sterile saline solution (0.9% (wt/vol) saline) | Farmace | 105851 | |
Methyl Blue | Sigma-Aldrich Chemicals | M5528 | |
MILLIPLEX MAP Mouse Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel – Immunology Multiplex Assay | MERCK | MCYTOMAG-70K | Simultaneously analyze multiple cytokine and chemokine biomarkers with Bead-Based Multiplex Assays using the Luminex technology, in mouse serum, plasma and cell culture samples. |
Amylase Assay | Labtest | 11 | |
Desmarres retractor 13-mm width |
ROBOZ | RS-6672 |