الصوديوم Taurocholate الناجم عن التهاب البنكرياس الحاد الحاد في C57BL/6 الفئران
Summary
نماذج حيوانية لالتهاب البنكرياس الحاد الشديد تمكن من دراسة التغيرات المرضية الفسيولوجية في المرحلة الأولية ، مما يسهل مراقبة تطور الأحداث الالتهابية. هنا نقدم بروتوكولا لتحريض التهاب البنكرياس الصفراوي الحاد الشديد عن طريق ضخ التوروتشولات الصوديوم إلى القناة البنكرياسية للفئران C57BL/6 المخدرة.
Abstract
وقد تم استخدام التهاب البنكرياس الحاد الصفراوي عن طريق ضخ تاوروشولات الصوديوم على نطاق واسع من قبل المجتمع العلمي بسبب تمثيل الحالة السريرية البشرية وتكاثر الأحداث الالتهابية المقابلة لبداية التهاب البنكرياس الصفراوي السريري. يمكن تقييم شدة تلف البنكرياس عن طريق قياس تركيز وسرعة وحجم حمض الصفراء المشبع. تقدم هذه الدراسة قائمة محدثة بالمواد والأساليب المستخدمة في تكاثر البروتوكول وتظهر النتائج الرئيسية لهذا النموذج الحاد لالتهاب البنكرياس (AP). وقد اقتصرت معظم المنشورات السابقة على استنساخ هذا النموذج في الفئران. وقد طبقنا هذه الطريقة على الفئران، التي توفر مزايا إضافية (أي توافر ترسانة من الكواشف والأجسام المضادة لهذه الحيوانات إلى جانب إمكانية العمل مع سلالات الفئران المعدلة وراثيا) التي قد تكون ذات صلة بالدراسة. بالنسبة لتحريض التهاب البنكرياس الحاد في الفئران ، نقدم بروتوكولا منهجيا ، بجرعة محددة من taurocholate الصوديوم بنسبة 2.5٪ بسرعة ضخ 10 ميكرولتر / دقيقة لمدة 3 دقائق في C57BL /6 الفئران التي تصل إلى مستواها الأقصى من الشدة في غضون 12 ساعة من الحث وتسليط الضوء على النتائج مع النتائج التي تثبت صحة الطريقة. مع الممارسة والتقنية ، فإن إجمالي الوقت المقدر ، من تحريض التخدير إلى الانتهاء من التسريب ، هو 25 دقيقة لكل.
Introduction
في البشر ، وجود حصى في المرارة هو السبب الأكثر شيوعا لالتهاب البنكرياس بسبب انسداد الجزء النهائي من choledochal ، مما يقطع تدفق إفرازات البنكرياس ويسبب عملية التهابية مكثفة في البنكرياس ، مع زيادة في تركيز الإنزيمات الهضمية في المصل والوسطاء الالتهابيين1،2.
وقد اقترحت نظريتين مختلفتين لشرح تطور التهاب البنكرياس الحاد (ا ف ب). تشير نظرية “القناة الشائعة” إلى أن الأحجار الموجودة في المرارة تعوق نظام القناة الصفراوية المشتركة البعيدة ، مما يسمح للإفراز الصفراوي بالتدفق إلى الوراء في قناة البنكرياس. النظرية الثانية (نظرية “انسداد القناة”) تشير إلى أن انسداد القناة البنكرياسية عن طريق حصى في المرارة الزائدة يسبب انسدادا في تدفق إفراز البنكرياس إلى الاثني عشر ، مما يسبب ارتفاع ضغط الدم القناة3. على الرغم من أن الآليات التي تؤدي إلى التهاب البنكرياس الصفراوي الحاد غير مفهومة تماما ، إلا أن النتيجة هي عملية التهابية مكثفة. يؤدي ثوران إنزيم الجهاز الهضمي والهضم الذاتي للبنكرياس إلى تغيرات في الهسطولوجيا ، وزيادة في السيتوكينات الالتهابية (IL-1β ، IL-6 ، TNF-α) في السائل المؤانس والمصل ، وزيادة في بروتينات المرحلة الحادة4،5،6.
التهاب البنكرياس الحاد الحاد هو حالة تستحق الاهتمام السريري بسبب مشاركة أعضاء متعددة وارتفاع خطر الوفيات. النماذج الحيوانية لتكاثر التهاب البنكرياس الحاد (AP) مهمة لأن هذه تشرح الآليات المرضية المرضية للمرض وتساعد في رصد تطور الأحداث الالتهابية ، بدءا من المراحل الأولية للمرض. هذا عادة غير ممكن في العيادات2,7. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الوصول إلى أنسجة البنكرياس أمر سهل في الدراسات قبل السريرية ، ويفضل توضيح التغيرات المرتبطة بالظروف السريرية8 إلى جانب إمكانية العمل مع الأنواع متساوية المنشأ ، والقضاء على المتغيرات غير المرغوب فيها ، وعكس التشابه السريري مع النتائج الملاحظة في الحالة البشرية9.
وقد درست نماذج الصفراوية وغير الصفراوية لتحريض التهاب البنكرياس الحاد في الفئران والجرذان الأنواع في كثير من الأحيان في الأدبيات العلمية. وتشمل الأساليب غير الصفراوية للتحريض إعطاء جرعات تحفيز فوق ماكسيمال من المرارة سيكريتاغوجي أو cerulein10 التناظرية; إعطاء جرعات قاتلة تقريبا من ارجينين; أو إدارة نظام غذائي نقص الكولين تكملها ethionine11. على الرغم من أن هذه الأساليب سهلة التكاثر وتؤدي إلى التهاب البنكرياس ، إلا أنها لا تكرر الآليات التي تؤدي نظريا إلى AP (أي ارتجاع إفراز الصفراء في قناة البنكرياس). تعتمد التقنية التي تعالج النموذج الصفراوي على التسريب الرجعي للأحماض الصفراوية في قناة البنكرياس وتتطلب باحثين مدربين تدريبا جيدا لتنفيذ هذا البروتوكول. وقد نشرت عدة دراسات باستخدام هذه الطريقة في الفئران (لأسباب تقنية على ما يبدو لأن هذه التجارب تنطوي على العمليات الجراحية)12,13. ومع ذلك ، فإن النهج في الفئران قد يقدم نتائج أكثر إثارة للاهتمام في دراسة الالتهاب3،14،15. في هذه الدراسة، سوف نعرض قائمة مرجعية من الخطوات التي يتعين اتباعها لتكاثر التهاب البنكرياس الحاد الشديد عن طريق ضخ توروتشولات الصوديوم في الفئران المخدرة C57BL/6.
بالنسبة للأعمال التي تنطوي على الحاجة إلى تجارب مع الأجسام المضادة وتحليل التعبير الجيني والبروتيني ، فإن استخدام الفئران هو الأفضل بسبب الترسانة الأكبر من المواد لهذه الحيوانات وإمكانية العمل مع الأنواع المتساوية وال بالضربة القاضية ، من بين أمور أخرى يمكن استخدامها ذات الصلة بالدراسات16. الفئران C57BL/6 هو سلالة أصيلة من الفئران وضعت أصلا لدراسة نشاط مضاد للورم وعلم المناعة. ويفضل الباحثون هذه السلالة بشكل متزايد لكونها متساوية المنشأ، مما يسمح بإعادة إنتاج أكبر للنتائج، مما قد يعني استخدام عدد أقل من الحيوانات في تجربة وأقل تقلبا في النتائج بين نفس المجموعة 17,18.
بيريدس وآخرون (2010)14 نشر بروتوكولا للتحريض AP في الفئران عن طريق ضخ تاوروشولات الصوديوم. هنا نقوم بتحديث هذا النموذج باستخدام تركيز taurocholate الصوديوم أعلى (2.5٪) في الفئران C57BL/6، مع حجم محدد وسرعة التسريب (الشكل 1). يتم الوصول إلى المستوى الأقصى من الشدة في غضون 12 ساعة من التعريفي في الفئران. يرتبط ارتفاع تركيز IL-6 في كل من المصل وفي التجويف البريتوني مع تطور AP. مع الممارسة ، فإن إجمالي الوقت المقدر من تحريض التخدير إلى الانتهاء من التسريب ، هو 25 دقيقة لكل. من الضروري أن يقوم باحث مدرب بإجراء هذه التجربة. لضمان حقن المحلول بشكل صحيح في القناة الصفراوية الشائعة ، قم بإجراء العديد من الدورات التدريبية التجريبية باستخدام الميثيلين الأزرق بدلا من تاوروشولات الصوديوم.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد ثبت بالفعل طريقة الحث على التهاب البنكرياس الحاد عن طريق ضخ توروتشولات الصوديوم إلى الوراء في rats22,23,24. وكانت ثلاثة أعمال مماثلة، نشرت في ال أعوام 2008 و2010 و2015، بمثابة مرجع للبروتوكول 3,14,15</…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب بفضل برنامج ما بعد التخرج في العيادة الطبية في جامعة ساو باولو; كلية الطب بجامعة ساو باولو
Materials
| 0.4 mm needle | INTRAG MEDICAL TECH | 90183210 | 30G |
| 0.54 mm polyethylene tube | Tygon | 730010 | – |
| Styrofoam block | – | – | – |
| masking tape for mounting the mouse | Missner | 1236 | – |
| Infusion pump scheduled to 10µL / min. | Havard aparatus-Peristaltic Pump Series | MA1 55-7766 | Model 66 Small Peristaltic |
| Scissors and forceps | |||
| Antiseptic providine iodine | Pfizer | 12086OR | antisepsis |
| 70% ethanol | SIGMA | 459836 | Mix 700 mL 100% ethanol with 300 mL dH2O |
| Razor blade | Lord | bdk9a1ghk6 | For trichotomy |
| Sodium taurocholate | Sigma-Aldrich | 86339- 1G | CAS NUMBER- 345909-26-4 |
| microvessel clip | Medicon Surgical | 56.87.35 | Approximator, opening 4.0 mm, closing pressure 30 - 40 g |
| 6-0 prolene | Bioline | 5162 | Suture line |
| Ketamin NP (cloridrato de dextrocetamina) 50mg/mL | Cristália | ||
| Xilazine 2% | Syntec | ||
| Sterile saline solution (0.9% (wt/vol) saline) | Farmace | 105851 | |
| Methyl Blue | Sigma-Aldrich Chemicals | M5528 | |
| MILLIPLEX MAP Mouse Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel – Immunology Multiplex Assay | MERCK | MCYTOMAG-70K | Simultaneously analyze multiple cytokine and chemokine biomarkers with Bead-Based Multiplex Assays using the Luminex technology, in mouse serum, plasma and cell culture samples. |
| Amylase Assay | Labtest | 11 | |
| Desmarres retractor 13-mm width |
ROBOZ | RS-6672 |
References
- Li, X., et al. Significantly different clinical features between hypertriglyceridemia and biliary acute pancreatitis: A retrospective study of 730 patients from a tertiary center. BMC Gastroenterology. 18 (1), 1-8 (2018).
- Rechreche, H., Abbes, A., Iovanna, J. L. Induction of antioxidant mechanisms in lung during experimental pancreatitis in rats. Indian Journal of Experimental Biology. 58 (5), 297-305 (2020).
- T, L., et al. Intraductal infusion of taurocholate followed by distal common bile duct ligation leads to a severe necrotic model of pancreatitis in mice. Pancreas. 44 (3), (2015).
- Botoi, G., Andercou, A. Interleukin 17-prognostic marker of severe acute pancreatitis. Chirurgia. 104 (4), 431-438 (2009).
- Li, D., Li, J., Wang, L., Zhang, Q. Association between IL-1beta, IL-8, and IL-10 polymorphisms and risk of acute pancreatitis. Genetics and Molecular Research. 14 (2), 6635-6641 (2015).
- Feng, C., et al. Effect of peritoneal lavage with ulinastatin on the expression of NF-kappaB and TNF-alpha in multiple organs of rats with severe acute pancreatitis. Experimental and Therapeutic Medicine. 10 (6), 2029-2034 (2015).
- Fang, D. Z., et al. Effects of sildenafil on inflammatory injury of the lung in sodium taurocholate-induced severe acute pancreatitis rats. International Immunopharmacology. 80, (2020).
- Ceranowicz, P., Cieszkowski, J., Warzecha, Z., Dembinski, A. Experimental models of acute pancreatitis. Postępy Higieny i Medycyny Doświadczalnej(Online). 69, 264-269 (2015).
- Wan, M. H., et al. Review of experimental animal models of biliary acute pancreatitis and recent advances in basic research. HPB (Oxford). 14 (2), 73-81 (2012).
- Mayerle, J., Sendler, M., Lerch, M. M. Secretagogue (Caerulein) induced pancreatitis in rodents. Pancreapedia: The Exocrine Pancreas Knowledge Base. (1), (2013).
- Wang, N., et al. Resveratrol protects against L-arginine-induced acute necrotizing pancreatitis in mice by enhancing SIRT1-mediated deacetylation of p53 and heat shock factor 1. International Journal of Molecular Medicine. 40 (2), 427-437 (2017).
- Ma, Z. H., et al. Effect of resveratrol on peritoneal macrophages in rats with severe acute pancreatitis. Inflammation Research. 54 (12), 522-527 (2005).
- Souza, L. J., et al. Anti-inflammatory effects of peritoneal lavage in acute pancreatitis. Pancreas. 39 (8), 1180-1184 (2010).
- Perides, G., Acker, G. J. v., Laukkarinen, J. M., Steer, M. L. Experimental acute biliary pancreatitis induced by retrograde infusion of bile acids into the mouse pancreatic duct. Nature Protocols. 5 (2), 335-341 (2010).
- Wittel, U. A., et al. Taurocholate-induced pancreatitis: a model of severe necrotizing pancreatitis in mice. Pancreas. 36 (2), 9-21 (2008).
- Tao, L., Reese, T. A. Making mouse models that reflect human immune responses. Trends Immunology. 38 (3), 181-193 (2017).
- Vandamme, T. F. Use of rodents as models of human diseases. Journal of Pharmacy and Bioallied Science. 6 (1), 2-9 (2014).
- Song, H. K., Hwang, D. Y. Use of C57BL/6N mice on the variety of immunological researches. Laboratory Animal Research. 33 (2), 119-123 (2017).
- Bogdanske, J. J., Stelle, S. H. -. V., Riley, M. V., Schiffman, B. M. . Suturing Principles and Techniques in Laboratory Animal Surgery. 1st edition. (1), (2010).
- Ray, A., Dittel, B. N. Isolation of mouse peritoneal cavity cells. Journal of Visualized Experiments. (35), e1488 (2010).
- Schmidt, J., et al. A better model of acute pancreatitis for evaluating therapy. Annals of Surgery. 215 (1), 44-56 (1992).
- Liu, D. L., et al. Resveratrol improves the therapeutic efficacy of bone marrow-derived mesenchymal stem cells in rats with severe acute pancreatitis. International Immunopharmacology. 80, 106128 (2020).
- Yang, X. F., et al. Chaiqin chengqi decoction alleviates severe acute pancreatitis associated acute kidney injury by inhibiting endoplasmic reticulum stress and subsequent apoptosis. Biomedicine & Pharmacotherapy. 125 (12), 110024 (2020).
- Yang, X. F., et al. Chaiqin chengqi decoction alleviates severe acute pancreatitis associated acute kidney injury by inhibiting endoplasmic reticulum stress and subsequent apoptosis. Biomedicine & Pharmacotherapy. 125, 110024 (2020).
- Venglovecz, V., Z, R., Hegyi, P. The effects of bile acids on pancreatic ductal cells. Pancreapedia: The Exocrine Pancreas Knowledge Base. (1), (2019).
- Roberts, S. E., Akbari, A., Thorne, K., Atkinson, M., Evans, P. A. The incidence of acute pancreatitis: impact of social deprivation, alcohol consumption, seasonal and demographic factors. Alimentary Pharmacology and Therapeutics. 38 (5), 539-548 (2013).
- Lerch, M. M., Gorelick, F. S. Models of acute and chronic pancreatitis. Gastroenterology. 144 (6), 1180-1193 (2013).
- Nakamura, K., Fukatsu, K., Sasayama, A., Yamaji, T. An immune-modulating formula comprising whey peptides and fermented milk improves inflammation-related remote organ injuries in diet-induced acute pancreatitis in mice. Biosci Microbiota Food Health. 37 (1), 1-8 (2018).
- Kui, B., et al. New insights into the methodolgy of L-Arginine-induced acute pancreatitis. PLoS One. 10 (2), 011758 (2015).
- Xue, J., et al. Alternatively activated macrophages promote pancreatic fibrosis in chronic pancreatitis. Nature Communication. 6, 7158 (2015).
- Lesina, M., Wormann, S. M., Neuhofer, P., Song, L., Algul, H. Interleukin-6 in inflammatory and malignant diseases of the pancreas. Seminars in Immunology. 26 (1), 80-87 (2014).
- Rao, S. A., Kunte, A. R. Interleukin-6: An early predictive marker for severity of acute pancreatitis. Indian Journal of Critical Care Medicine. 21 (7), 424-428 (2017).
