Natrium taurocholat induceret svær akut pancreatitis i C57BL/6 Mus

Summary

Dyremodeller for alvorlig akut pancreatitis muliggør undersøgelse af patofysiologiske ændringer i den indledende fase, hvilket letter observation af udviklingen af inflammatoriske begivenheder. Her giver vi en protokol for induktion af svær akut galde pancreatitis ved retrograd infusion af natrium taurocholat i bugspytkirtlen kanalen af bedøvet C57BL/6 mus.

Abstract

Galde akut betændelsesinduktion ved natrium taurocholatinfusion er blevet meget udbredt af det videnskabelige samfund på grund af repræsentationen af den menneskelige kliniske tilstand og reproduktion af inflammatoriske hændelser svarende til udbrud af klinisk galde pancreatitis. Sværhedsgraden af bugspytkirtelskader kan vurderes ved at måle koncentrationen, hastigheden og mængden af den infunderede galdesyre. Denne undersøgelse giver en opdateret tjekliste over de materialer og metoder, der anvendes i protokollen reproduktion og viser de vigtigste resultater fra denne akutte pancreatitis (AP) model. De fleste af de tidligere publikationer har begrænset sig til at reproducere denne model hos rotter. Vi har anvendt denne metode i mus, hvilket giver yderligere fordele (dvs. tilgængeligheden af et arsenal af reagenser og antistoffer til disse dyr sammen med muligheden for at arbejde med genetisk modificerede stammer af mus), der kan være relevante for undersøgelsen. For akut induktion af pancreatitis hos mus præsenterer vi en systematisk protokol med en defineret dosis på 2,5 % natrium taurocholat ved infusionshastighed 10 μL/min i 3 min i C57BL/6 mus, der når sit maksimale sværhedsgradsniveau inden for 12 timer efter induktion og fremhæver resultater med resultater, der validerer metoden. Med praksis og teknik er den samlede anslåede tid, fra induktion af anæstesi til afslutningen af infusionen, 25 min pr. Dyr.

Introduction

Hos mennesker er tilstedeværelsen af galdesten den mest almindelige årsag til bugspytkirtel på grund af obstruktionen af den terminale del af choledochal, afbryder strømmen af bugspytkirtelsekretioner og forårsager en intens inflammatorisk proces i bugspytkirtlen med en stigning i koncentrationen af fordøjelsesenzymer i serum og inflammatoriske ^mæglere1,2.

To forskellige teorier er blevet foreslået at forklare udviklingen af akut pancreatitis (AP). Den “fælles kanal” teori tyder på, at stenene til stede i galdeblæren hindre distal fælles galdegang system, så galde sekretion til at flyde tilbageskridt i bugspytkirtlen kanalen. Den anden teori (“kanal obstruktion” teori) tyder på, at obstruktion af bugspytkirtlen kanalen ved overskydende galdesten forårsager en blokering i strømmen af bugspytkirtel sekretion til duodenum, forårsager ductal hypertension3. Selv om de mekanismer, der fører til akut galde pancreatitis ikke er fuldt forstået, resultatet er en intens inflammatorisk proces. Fordøjelsesenzymudbrud og bugspytkirtel selvfordøjelse føre til histopatologiske ændringer, en stigning i inflammatoriske cytokiner (IL-1β, IL-6, TNF-α) i ascitisk væske og serum, og en stigning i akut fase ^{proteiner4,5,6}.

Alvorlig akut pancreatitis er en tilstand, der fortjener klinisk opmærksomhed på grund af inddragelse af flere organer og en høj dødelighed risiko. Dyremodeller til reproduktion af akut pancreatitis (AP) er vigtige, da disse forklarer sygdommens patofysiologiske mekanismer og hjælper med at overvåge udviklingen af inflammatoriske begivenheder, startende fra de indledende stadier af sygdommen. Dette er normalt ikke muligt i ^{klinikkerne2,7}. Derudover er adgang til bugspytkirtelvæv let i prækliniske undersøgelser, der favoriserer udredningen af ændringer forbundet med kliniske ^tilstande8 sammen med muligheden for at arbejde med isogene arter, eliminere uønskede variabler og spejle klinisk lighed med de resultater, der observeres i den menneskelige ^tilstand9.

Galde- og ikke-galdemodeller til induktion af akut pancreatitis hos rotter og mus arter er ofte blevet undersøgt i den videnskabelige litteratur. Ikke-galde metoder til induktion omfatter administration af supramaximal stimulerende doser af cholecystokinin secretagogue eller dens analoge ^cerulein10; administration af næsten dødelige doser af L-arginin; eller administration af en cholin-mangelfuld kost suppleret med ^ethionin11. Selv om disse metoder er nemme at reproducere og resultere i bugspytkirtelbetændelse, de ikke replikere de mekanismer, der i teorien udløser AP (dvs., refluks af galde sekretion i bugspytkirtlen kanalen). Den teknik, der adresserer galdemodellen er baseret på retrograd infusion af galdesyrer i bugspytkirtlen kanalen og kræver veluddannede forskere til at udføre denne protokol. Flere undersøgelser er blevet offentliggjort ved hjælp af denne metode hos rotter (tilsyneladende af tekniske årsager, da disse forsøg involverer kirurgiske procedurer)^12,13. Men, tilgangen i mus kan tilbyde mere interessante resultater i studiet af inflammation3,14,15. I denne undersøgelse vil vi vise en tjekliste over de trin, der skal følges til reproduktion af alvorlig akut pancreatitis ved infusion af natrium taurocholat i C57BL/6 bedøvede mus.

For værker, der involverer behovet for forsøg med antistoffer og analyse af gen- og proteinekspressionen, er brugen af mus at foretrække på grund af det større arsenal af materialer til disse dyr og muligheden for at arbejde med isogen- og knockoutarter, blandt andre, der kan bruges relevante for ^{undersøgelser16}. Mus C57BL/6 er en indavlet stamme af mus, der oprindeligt blev udviklet til undersøgelse af antitumoraktivitet og immunologi. Denne stamme foretrækkes i stigende grad af forskere for at være isogen, hvilket giver mulighed for en større reproducerbarhed af resultater, hvilket kan indebære anvendelse af et mindre antal dyr i et forsøg og mindre variation i resultaterne mellem den samme ^gruppe17,18.

Perides et al. (2010)¹⁴ offentliggjorde en protokol for AP induktion hos mus ved natrium taurocholat infusion. Her opdaterer vi denne model ved hjælp af en højere natrium taurocholatkoncentration (2,5%) i C57BL/6 mus med et defineret volumen og infusionshastighed (figur 1). Det maksimale sværhedsgradsniveau nås inden for 12 timer efter induktion hos mus. Højden af koncentrationen af IL-6 både i serum og i bughulen er korreleret med progressionen af AP. Med praksis er den samlede anslåede tid fra induktion af anæstesi til afslutningen af infusionen 25 min pr. Dyr. Det er vigtigt, at en uddannet forsker udfører dette eksperiment. For at sikre, at opløsningen sprøjtes korrekt ind i den fælles galdegang, skal du udføre flere pilottræningssessioner ved hjælp af methylenblåt i stedet for natrium taurocholat.

Protocol

Denne protokol blev godkendt af den etiske komité for brug af dyr fra USP Medicine School, Num. Project: 1343/2019-CEUA: FMUSP. Til denne protokol blev der anvendt C57BL/6 mus på 6 uger, der vejede 20 ± 2 g (n = 9/gruppe). 1. Laparotomi Bedøve dyr med xylazin (10 mg/kg) og ketaminopløsning (80 mg/kg), subkutant (0,1 mL/10g kropsvægt) ved hjælp af en 1 mL sprøjte og 13×0,45 mm nål 26G 1/2. Kontroller for tilstrækkelig anæstesi dybde ved at klemme tåen. Styr kropstemperatur…

Representative Results

Pancreatitis sværhedsgrad blev scoret mellem 0-3 i henhold til Schmidt’s skala21 , hvor nul svarer til fraværet, 1 svarer til en mild tilstedeværelse ( 50%) (tabel 1). De udførte målinger var plasma amylase aktivitet, bugspytkirtelødem, acinar celle, skade / nekrose, bugspytkirtelbetændelse (ved histologi analyse af H &E-farvede se…

Discussion

Metoden til at fremkalde akut pancreatitis ved retrograd natrium taurocholat infusion er allerede blevet påvist hos rotter22,23,24. Tre lignende værker, der blev offentliggjort i 2008, 2010 og 2015, fungerede som reference for protokollen3,14,15. I dette arbejde opregner vi alle de kritiske trin til gengivelse af denne metode i C57BL/…

Materials

0.4 mm needle	INTRAG MEDICAL TECH	90183210	30G
0.54 mm polyethylene tube	Tygon	730010	–
Styrofoam block	–	–	–
masking tape for mounting the mouse	Missner	1236	–
Infusion pump scheduled to 10µL / min.	Havard aparatus-Peristaltic Pump Series	MA1 55-7766	Model 66 Small Peristaltic
Scissors and forceps
Antiseptic providine iodine	Pfizer	12086OR	antisepsis
70% ethanol	SIGMA	459836	Mix 700 mL 100% ethanol with 300 mL dH2O
Razor blade	Lord	bdk9a1ghk6	For trichotomy
Sodium taurocholate	Sigma-Aldrich	86339- 1G	CAS NUMBER- 345909-26-4
microvessel clip	Medicon Surgical	56.87.35	Approximator, opening 4.0 mm, closing pressure 30 - 40 g
6-0 prolene	Bioline	5162	Suture line
Ketamin NP (cloridrato de dextrocetamina) 50mg/mL	Cristália
Xilazine 2%	Syntec
Sterile saline solution (0.9% (wt/vol) saline)	Farmace	105851
Methyl Blue	Sigma-Aldrich Chemicals	M5528
MILLIPLEX MAP Mouse Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel – Immunology Multiplex Assay	MERCK	MCYTOMAG-70K	Simultaneously analyze multiple cytokine and chemokine biomarkers with Bead-Based Multiplex Assays using the Luminex technology, in mouse serum, plasma and cell culture samples.
Amylase Assay	Labtest	11
Desmarres retractor 13-mm width	ROBOZ	RS-6672