C57BL/6 Farelerde Sodyum Taurokolat İndüklenen Şiddetli Akut Pankreatit
Summary
Şiddetli akut pankreatit için hayvan modelleri, ilk aşamada patofizyolojik değişikliklerin incelenmesini sağlayarak enflamatuar olayların evriminin gözlemini kolaylaştırır. Burada, anestezi edilmiş C57BL/6 farelerin pankreas kanalına sodyum taurokolatın retrograd infüzyonu ile şiddetli akut safra pankreatit indüksiyonu için bir protokol sunuyoruz.
Abstract
Sodyum taurokolat infüzyonu ile safra akut pankreatit indüksiyonu, insan klinik durumunun temsili ve klinik safra pankreatitinin başlangıcına karşılık gelen enflamatuar olayların üremesi nedeniyle bilim topluluğu tarafından yaygın olarak kullanılmaktadır. Pankreas hasarının şiddeti, aşılanan safra asidinin konsantrasyonu, hızı ve hacmi ölçülerek değerlendirilebilir. Bu çalışma, protokol üremesinde kullanılan malzeme ve yöntemlerin güncellenmiş bir kontrol listesini sağlar ve bu akut pankreatit (AP) modelinin ana sonuçlarını gösterir. Önceki yayınların çoğu, bu modeli sıçanlarda yeniden üretmekle sınırlıdır. Bu yöntemi, çalışmayla ilgili olabilecek ek avantajlar (yani, bu hayvanlar için reaktifler ve antikorlardan oluşan bir cephaneliğin mevcudiyeti ve genetiği değiştirilmiş fare suşlarıyla çalışma imkanı) sağlayan farelerde uyguladık. Farelerde akut pankreatit indüksiyonu için, C57BL/6 farelerde 3 dakika boyunca 10 μL/dk infüzyon hızında% 2.5 sodyum taurocholate tanımlanmış bir doz ile sistematik bir protokol sunuyoruz ve indüksiyonun 12 saat içinde maksimum şiddet seviyesine ulaşıyor ve yöntemi doğrulayan sonuçlarla sonuçları vurguluyoruz. Uygulama ve teknikle, anestezinin indüksiyonundan infüzyonun tamamlanmasına kadar toplam tahmini süre hayvan başına 25 dk’dır.
Introduction
İnsanlarda, safra kesesi taşlarının varlığı, kolesochal’ın terminal kısmının tıkanması, pankreas salgılarının akışını kesmesi ve pankreasta yoğun bir enflamatuar sürece neden olması nedeniyle pankreatitin en yaygın nedenidir, serum ve enflamatuar mediatörlerde sindirim enzimlerinin konsantrasyonunda bir artış ile1,2.
Akut pankreatit (AP) gelişimini açıklamak için iki farklı teori önerilmiştir. “Ortak kanal” teorisi, safra kesesinde bulunan taşların distal ortak safra kanalı sistemini tıkadığını ve safra salgısının pankreas kanalına retrograd akmasını sağladığını öne sürmemektedir. İkinci teori (“kanal tıkanıklığı” teorisi), pankreas kanalının fazla safra kesesi taşları tarafından tıkanmasının duodenuma pankreas salgısının akışında tıkanmaya neden olduğunu ve düktal hipertansiyona neden olduğunu göstermektedir3. Akut safra pankreatitine yol açan mekanizmalar tam olarak anlaşılamasa da, sonuç yoğun bir enflamatuar süreçtir. Sindirim enzimi patlaması ve pankreas kendi kendine sindirim histopatolojik değişikliklere, assitik sıvı ve serumda enflamatuar sitokinlerde (IL-1β, IL-6, TNF-α) artışa ve akut faz proteinlerinde artışa yol açar4,5,6.
Şiddetli akut pankreatit, birden fazla organın tutulumu ve yüksek mortalite riski nedeniyle klinik dikkati hak eden bir durumdur. Akut pankreatit (AP) üremesi için hayvan modelleri önemlidir, çünkü bunlar hastalığın patofizyolojik mekanizmalarını açıklar ve hastalığın ilk aşamalarından başlayarak enflamatuar olayların evrimini izlemeye yardımcı olur. Bu genellikle kliniklerde mümkün değildir2,7. Ek olarak, preklinik çalışmalarda pankreas dokularına erişim kolaydır, klinik koşullara bağlı değişikliklerin aydınlatılmasını kolaylaştırır8 izojenik türlerle çalışma, istenmeyen değişkenleri ortadan kaldırma ve klinik benzerliği insan durumunda gözlenen sonuçlarla yansıtma olasılığı ile birlikte9.
Sıçanlarda ve fare türlerinde akut pankreatit indüksiyonu için safralı ve safrasız modeller bilimsel literatürde sıkça incelenmiştir. Safrasız indüksiyon yöntemleri arasında kolesistokinin secretagogunun veya analog cerulein10’un supramaximal uyarıcı dozlarının verilmesi; neredeyse ölümcül dozlarda L-arginin verilmesi; veya etionin11 ile desteklenmiş kolin eksikliği olan bir diyetin yönetimi. Bu yöntemlerin çoğaltılması ve pankreas iltihabı ile sonuçlanması kolay olsa da, teoride AP’yi tetikleyen mekanizmaları (yani safra salgısının pankreas kanalına reflü) çoğaltır. Safra modeline hitap eden teknik, safra asitlerinin pankreas kanalına retrograd infüzyonuna dayanır ve bu protokolü gerçekleştirmek için iyi eğitimli araştırmacılar gerektirir. Sıçanlarda bu yöntem kullanılarak çeşitli çalışmalar yayınlanmıştır (görünüşe göre bu deneyler cerrahi prosedürler içerdiğinden teknik nedenlerle)12,13. Bununla birlikte, farelerdeki yaklaşım iltihaplanma çalışmasında daha ilginç sonuçlar sunabilir3,14,15. Bu çalışmada, C57BL/6 anestezik farelerde sodyum taurokolat infüzyonu ile şiddetli akut pankreatit üremesi için izlenecek adımların bir kontrol listesini göstereceğiz.
Antikorlarla deneylere ve gen ve protein ekspresyonunun analiz edilmesine ihtiyaç duyan çalışmalar için, bu hayvanlar için daha fazla malzeme cephaneliği ve çalışmalarla ilgili kullanılabilecek diğerlerinin yanı sıra izojenik ve nakavt türleriyle çalışma olasılığı nedeniyle farelerin kullanımı tercih edilir16. Fareler C57BL/6, başlangıçta antitümör aktivite ve immünoloji çalışması için geliştirilen doğuştan gelen bir fare türüdür. Bu suş, araştırmacılar tarafından izojenik olduğu için giderek daha fazla tercih edilmekte ve bu da bir deneyde daha az sayıda hayvanın kullanıldığı ve aynı grup17,18 arasındaki sonuçların daha az değişkenliği anlamına gelebilecek sonuçların daha fazla tekrarlanabilirliğine izinmektedir.
Perides ve ark. (2010)14 , sodyum taurokolat infüzyonu ile farelerde AP indüksiyonu için bir protokol yayınladı. Burada bu modeli, tanımlanmış bir hacim ve infüzyon hızı ile C57BL / 6 farelerde daha yüksek sodyum taurokolat konsantrasyonu (% 2.5) kullanarak güncelleriz (Şekil 1). Maksimum şiddet seviyesine farelerde indüksiyondan 12 saat içinde ulaşılır. IL-6 konsantrasyonunun hem serumda hem de periton boşluğunda yükselmesi AP’nin ilerlemesi ile ilişkilidir. Pratikte, anestezinin indüksiyonundan infüzyonun tamamlanmasına kadar geçen toplam tahmini süre hayvan başına 25 dk’dır. Bu deneyi eğitimli bir araştırmacının yapması şarttır. Çözeltinin ortak safra kanalına düzgün bir şekilde enjekte edildiğinden emin olmak için sodyum taurocholate yerine metilen mavisi kullanarak birkaç pilot eğitim seansı gerçekleştirin.
Protocol
Representative Results
Discussion
Retrograd sodyum taurokolat infüzyonu ile akut pankreatit indükleme yöntemi sıçanlarda zaten gösterilmiştir22,23,24. 2008, 2010 ve 2015’te yayınlanan üç benzer eser, protokol için referans olarak görev yaptı3,14,15. Bu çalışmada, bu yöntemi C57BL /6 farelerde yeniden üretmek için tüm kritik adımları ve doğrulamak …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, São Paulo Üniversitesi Tıp Kliniği’ndeki Mezuniyet Sonrası Programı sayesinde; Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) ve São Paulo Üniversitesi Tıp Fakültesi (FMUSP).
Materials
| 0.4 mm needle | INTRAG MEDICAL TECH | 90183210 | 30G |
| 0.54 mm polyethylene tube | Tygon | 730010 | – |
| Styrofoam block | – | – | – |
| masking tape for mounting the mouse | Missner | 1236 | – |
| Infusion pump scheduled to 10µL / min. | Havard aparatus-Peristaltic Pump Series | MA1 55-7766 | Model 66 Small Peristaltic |
| Scissors and forceps | |||
| Antiseptic providine iodine | Pfizer | 12086OR | antisepsis |
| 70% ethanol | SIGMA | 459836 | Mix 700 mL 100% ethanol with 300 mL dH2O |
| Razor blade | Lord | bdk9a1ghk6 | For trichotomy |
| Sodium taurocholate | Sigma-Aldrich | 86339- 1G | CAS NUMBER- 345909-26-4 |
| microvessel clip | Medicon Surgical | 56.87.35 | Approximator, opening 4.0 mm, closing pressure 30 - 40 g |
| 6-0 prolene | Bioline | 5162 | Suture line |
| Ketamin NP (cloridrato de dextrocetamina) 50mg/mL | Cristália | ||
| Xilazine 2% | Syntec | ||
| Sterile saline solution (0.9% (wt/vol) saline) | Farmace | 105851 | |
| Methyl Blue | Sigma-Aldrich Chemicals | M5528 | |
| MILLIPLEX MAP Mouse Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel – Immunology Multiplex Assay | MERCK | MCYTOMAG-70K | Simultaneously analyze multiple cytokine and chemokine biomarkers with Bead-Based Multiplex Assays using the Luminex technology, in mouse serum, plasma and cell culture samples. |
| Amylase Assay | Labtest | 11 | |
| Desmarres retractor 13-mm width |
ROBOZ | RS-6672 |
References
- Li, X., et al. Significantly different clinical features between hypertriglyceridemia and biliary acute pancreatitis: A retrospective study of 730 patients from a tertiary center. BMC Gastroenterology. 18 (1), 1-8 (2018).
- Rechreche, H., Abbes, A., Iovanna, J. L. Induction of antioxidant mechanisms in lung during experimental pancreatitis in rats. Indian Journal of Experimental Biology. 58 (5), 297-305 (2020).
- T, L., et al. Intraductal infusion of taurocholate followed by distal common bile duct ligation leads to a severe necrotic model of pancreatitis in mice. Pancreas. 44 (3), (2015).
- Botoi, G., Andercou, A. Interleukin 17-prognostic marker of severe acute pancreatitis. Chirurgia. 104 (4), 431-438 (2009).
- Li, D., Li, J., Wang, L., Zhang, Q. Association between IL-1beta, IL-8, and IL-10 polymorphisms and risk of acute pancreatitis. Genetics and Molecular Research. 14 (2), 6635-6641 (2015).
- Feng, C., et al. Effect of peritoneal lavage with ulinastatin on the expression of NF-kappaB and TNF-alpha in multiple organs of rats with severe acute pancreatitis. Experimental and Therapeutic Medicine. 10 (6), 2029-2034 (2015).
- Fang, D. Z., et al. Effects of sildenafil on inflammatory injury of the lung in sodium taurocholate-induced severe acute pancreatitis rats. International Immunopharmacology. 80, (2020).
- Ceranowicz, P., Cieszkowski, J., Warzecha, Z., Dembinski, A. Experimental models of acute pancreatitis. Postępy Higieny i Medycyny Doświadczalnej(Online). 69, 264-269 (2015).
- Wan, M. H., et al. Review of experimental animal models of biliary acute pancreatitis and recent advances in basic research. HPB (Oxford). 14 (2), 73-81 (2012).
- Mayerle, J., Sendler, M., Lerch, M. M. Secretagogue (Caerulein) induced pancreatitis in rodents. Pancreapedia: The Exocrine Pancreas Knowledge Base. (1), (2013).
- Wang, N., et al. Resveratrol protects against L-arginine-induced acute necrotizing pancreatitis in mice by enhancing SIRT1-mediated deacetylation of p53 and heat shock factor 1. International Journal of Molecular Medicine. 40 (2), 427-437 (2017).
- Ma, Z. H., et al. Effect of resveratrol on peritoneal macrophages in rats with severe acute pancreatitis. Inflammation Research. 54 (12), 522-527 (2005).
- Souza, L. J., et al. Anti-inflammatory effects of peritoneal lavage in acute pancreatitis. Pancreas. 39 (8), 1180-1184 (2010).
- Perides, G., Acker, G. J. v., Laukkarinen, J. M., Steer, M. L. Experimental acute biliary pancreatitis induced by retrograde infusion of bile acids into the mouse pancreatic duct. Nature Protocols. 5 (2), 335-341 (2010).
- Wittel, U. A., et al. Taurocholate-induced pancreatitis: a model of severe necrotizing pancreatitis in mice. Pancreas. 36 (2), 9-21 (2008).
- Tao, L., Reese, T. A. Making mouse models that reflect human immune responses. Trends Immunology. 38 (3), 181-193 (2017).
- Vandamme, T. F. Use of rodents as models of human diseases. Journal of Pharmacy and Bioallied Science. 6 (1), 2-9 (2014).
- Song, H. K., Hwang, D. Y. Use of C57BL/6N mice on the variety of immunological researches. Laboratory Animal Research. 33 (2), 119-123 (2017).
- Bogdanske, J. J., Stelle, S. H. -. V., Riley, M. V., Schiffman, B. M. . Suturing Principles and Techniques in Laboratory Animal Surgery. 1st edition. (1), (2010).
- Ray, A., Dittel, B. N. Isolation of mouse peritoneal cavity cells. Journal of Visualized Experiments. (35), e1488 (2010).
- Schmidt, J., et al. A better model of acute pancreatitis for evaluating therapy. Annals of Surgery. 215 (1), 44-56 (1992).
- Liu, D. L., et al. Resveratrol improves the therapeutic efficacy of bone marrow-derived mesenchymal stem cells in rats with severe acute pancreatitis. International Immunopharmacology. 80, 106128 (2020).
- Yang, X. F., et al. Chaiqin chengqi decoction alleviates severe acute pancreatitis associated acute kidney injury by inhibiting endoplasmic reticulum stress and subsequent apoptosis. Biomedicine & Pharmacotherapy. 125 (12), 110024 (2020).
- Yang, X. F., et al. Chaiqin chengqi decoction alleviates severe acute pancreatitis associated acute kidney injury by inhibiting endoplasmic reticulum stress and subsequent apoptosis. Biomedicine & Pharmacotherapy. 125, 110024 (2020).
- Venglovecz, V., Z, R., Hegyi, P. The effects of bile acids on pancreatic ductal cells. Pancreapedia: The Exocrine Pancreas Knowledge Base. (1), (2019).
- Roberts, S. E., Akbari, A., Thorne, K., Atkinson, M., Evans, P. A. The incidence of acute pancreatitis: impact of social deprivation, alcohol consumption, seasonal and demographic factors. Alimentary Pharmacology and Therapeutics. 38 (5), 539-548 (2013).
- Lerch, M. M., Gorelick, F. S. Models of acute and chronic pancreatitis. Gastroenterology. 144 (6), 1180-1193 (2013).
- Nakamura, K., Fukatsu, K., Sasayama, A., Yamaji, T. An immune-modulating formula comprising whey peptides and fermented milk improves inflammation-related remote organ injuries in diet-induced acute pancreatitis in mice. Biosci Microbiota Food Health. 37 (1), 1-8 (2018).
- Kui, B., et al. New insights into the methodolgy of L-Arginine-induced acute pancreatitis. PLoS One. 10 (2), 011758 (2015).
- Xue, J., et al. Alternatively activated macrophages promote pancreatic fibrosis in chronic pancreatitis. Nature Communication. 6, 7158 (2015).
- Lesina, M., Wormann, S. M., Neuhofer, P., Song, L., Algul, H. Interleukin-6 in inflammatory and malignant diseases of the pancreas. Seminars in Immunology. 26 (1), 80-87 (2014).
- Rao, S. A., Kunte, A. R. Interleukin-6: An early predictive marker for severity of acute pancreatitis. Indian Journal of Critical Care Medicine. 21 (7), 424-428 (2017).
