Fotoimunoterapia infravermelha próxima para modelos de mouse de disseminação pleural

Summary

A fotoimunoterapia quase infravermelha (NIR-PIT) é uma estratégia terapêutica emergente do câncer que utiliza um conjugado de anticorpos fotoabsorto (IR700Dye) e luz NIR para destruir células cancerosas. Aqui, apresentamos um método para avaliar o efeito antitumoral do NIR-PIT em um modelo de camundongo de câncer de pulmão disseminado pleural e mesotelioma pleural maligno usando bioluminescência por imagem.

Abstract

A eficácia da fotoimmunoterapia pode ser avaliada com mais precisão com um modelo de rato ortotópico do que com um subcutâneo. Um modelo de disseminação pleural pode ser utilizado para a avaliação de métodos de tratamento para doenças intratorácicas, como câncer de pulmão ou mesotelioma pleural maligno.

A fotoimuneterapia quase infravermelha (NIR-PIT) é uma estratégia de tratamento de câncer recentemente desenvolvida que combina a especificidade dos anticorpos alvo de tumores com toxicidade causada por um fotoabsorto (IR700Dye) após a exposição à luz NIR. A eficácia do NIR-PIT tem sido relatada usando vários anticorpos; no entanto, apenas alguns relatórios mostraram o efeito terapêutico dessa estratégia em um modelo ortotópico. No presente estudo, demonstramos um exemplo de avaliação da eficácia do modelo de câncer de pulmão disseminado pleural, que foi tratado utilizando NIR-PIT.

Introduction

O câncer continua sendo uma das principais causas de mortalidade, apesar de décadas de pesquisa. Uma das razões é que a radioterapia e a quimioterapia são técnicas altamente invasivas, o que pode limitar seus benefícios terapêuticos. Terapias de alvo celular ou molecular, que são técnicas menos invasivas, estão recebendo maior atenção. Fotoimmunoterapia é um método de tratamento que aumenta sinérgicamente o efeito terapêutico combinando imunoterapia e fototerapia. A imunoterapia aumenta a imunidade tumoral aumentando a imunogenicidade do microambiente tumoral e reduzindo a supressão imunoregulatória, resultando na destruição de tumores no corpo. A fototerapia destrói tumores primários com uma combinação de fotosensibilizadores e raios de luz, e antígenos específicos do tumor liberados das células tumorais aumentam a imunidade tumoral. Os tumores podem ser tratados seletivamente usando fotosensibilizadores, pois são específicos e seletivos para as células-alvo. A modalidade de fototerapia inclui terapia fotodinâmica (TT), terapia fototérmica (PTT) e terapias à base de fotoquímica¹.

A fotoimuneterapia quase infravermelha (NIR-PIT) é um método recentemente desenvolvido de fototerapia antitumoral que combina terapia fotoquímica e imunoterapia^1,2. NIR-PIT é uma terapia molecularmente direcionada que tem como alvo moléculas específicas da superfície celular através da conjugação de um corante de fttallocianina de silício quase infravermelho, IRdye 700DX (IR700), para um anticorpo monoclonal (mAb). A membrana celular da célula alvo é destruída após a irradiação com luz NIR (690 nm)³.

O conceito de usar terapia leve direcionada combinando fotosensibilizadores convencionais e anticorpos ou PDT direcionado tem mais de três décadas^{de idade 4,5}. Estudos anteriores tentaram atingir agentes convencionais do PDT conjugando-os a anticorpos. No entanto, houve um sucesso limitado porque esses conjugados estavam presos no fígado, devido à hidroofobidade dos fotosensibilizadores^6,7. Além disso, o mecanismo do NIR-PIT é completamente diferente do do PDT convencional. Fotosensibilizadores convencionais geram estresse oxidativo que resulta de uma conversão de energia que absorve energia leve, desloca para um estado animado, transita para o estado terrestre e causa apoptose. No entanto, o NIR-PIT causa necrose rápida ao destruir diretamente a membrana celular, agregando fotosensibilizadores na membrana através de uma reação fotoquímica⁸. NIR-PIT é superior ao PDT convencional de muitas maneiras. Fotosensibilizadores convencionais têm coeficientes de baixa extinção, exigindo a fixação de um grande número de fotosensibilizadores a uma única molécula de anticorpos, reduzindo potencialmente a afinidade vinculativa. A maioria dos fotosensibilizadores convencionais são hidrofóbicos, dificultando a vinculação dos fotosensibilizadores a anticorpos sem comprometer sua imunoreatividade ou acúmulo de alvos in vivo. Fotoensibilizadores convencionais normalmente absorvem luz na faixa visível, reduzindo a penetração de tecidos.

Vários estudos sobre nir-PIT direcionados a tumores intratoráculos, como câncer de pulmão e mesotelioma pleural maligno (MPM) foram relatados^{9,10,11,12,13,14,15,16,17}. No entanto, apenas alguns relatórios descreveram a eficácia do NIR-PIT nos modelos de MPM disseminados pleural ou câncer de pulmão^9,10,11,12. Os modelos de xenoenxerto tumor subcutâneo são considerados modelos de tumor padrão e atualmente são amplamente utilizados para avaliar os efeitos antitumorais das novas terapias¹⁸. No entanto, o microambiente tumoral subcutâneo não é permissivo para o desenvolvimento de uma estrutura tecidual adequada ou uma condição que recapitula adequadamente um verdadeiro fenótipo maligno^19,20,21,22. Idealmente, os modelos de doenças ortotópicas devem ser estabelecidos para uma avaliação mais precisa dos efeitos antitumorais.

Aqui, demonstramos um método de avaliação de eficácia em um modelo de camundongo de câncer de pulmão disseminado pleural, que foi tratado usando NIR-PIT. Um modelo de camundongo de disseminação pleural é gerado pela injeção de células tumorais na cavidade torácica e confirmado usando luminescência de luciferase. O camundongo foi tratado com uma injeção intravenosa de mAb conjugada com irrasiagem IR700 e NIR no peito. O efeito terapêutico foi avaliado por luminescência de luciferase.

Protocol

Todos os experimentos in vivo foram realizados em conformidade com o Guia de Cuidado e Uso de Recursos Laboratoriais de Animais do Comitê de Cuidados e Uso animal da Universidade de Nagoya (aprovação nº 2017-29438, #2018-30096, #2019-31234, #2020-20104). Camundongos nus homozigotos de seis semanas foram comprados e mantidos no Centro Animal da Universidade de Nagoya. Ao realizar o procedimento em camundongos, foram anestesiados com isoflurane (introdução: 4-5%, manutenção 2-3%); a pata foi pressionada co…

Representative Results

Anticorpo anti-podoplanina NZ-1 foi conjugado com IR700 para gerar NZ-1-IR700. Confirmamos a vinculação de NZ-1 e IR700 em um SDS-PAGE(Figura 8). A luciferase-expressing H2373 (H2373-luc) foi preparada por células de mesotelioma malignas transfecionantes (H2373) com um gene luciferase10. Nós anestesiamos camundongos nus homozigote atímicos de 8-12 semanas de idade e injetamos 1 × 10 células H2373-luc na cavidade torácica….

Discussion

Neste estudo, demonstramos um método de medição do efeito terapêutico do NIR-PIT no modelo de disseminação pleural do MPM. A matança celular altamente seletiva foi realizada com NIR-PIT; assim, o tecido normal quase não foi danificado^23,24,25. Com este tipo de matança celular seletiva, o NIR-PIT demonstrou ser seguro nos modelos disseminados^9,<sup class…

Materials

0.25w/v% Trypsin-1mmol/l EDTA 4Na Solution with Phenol Red	Wako	209-016941	for cell culture
1mL syringe	TERUMO	SS-01T	for mice experiment
30G needle	Nipro	1907613	for mice experiment
BALB/cSlc-nu/nu	Japan SLC
Collidal Blue Staining Kit	Invitrogen	LC6025	use for gel protein staining
Coomassie (bradford) Plus protein assay	Thermo Fisher Scientific Inc (Waltham, MA, USA)	PI-23200	for measuring the APC concentration
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Wako	043-07216	use for conjugation of IR700
D-Luciferin (potassium salt)	Cayman Chemical	14681	for bioluminescence imaging and DLIT
GraphPad Prism7	GraphPad software		for statistical analysis
Image Studio	Li-Cor Biosciences		for analyzing 700 nm fluorescent image
IRDye 700DX Ester Infrared Dye	LI-COR Bioscience (Lincoln, NE, USA)	929-70011
isoflurane	Wako	095-06573	for mice anesthesia
IVIS Spectrum CT	PerkinElmer		for capturing bioluminescent image and DLIT
Living Image	PerkinElmer		for analyzing bioluminescent image and DLIT
Na2HPO4	SIGMA-ALDRICH (St. Louis, MO, USA)	S9763	use for conjugation of IR700
NIR Laser	Changchun New Industries Optoelectronics Technology	MRL-III-690R	for NIR irradiation
Novex WedgeWell 4 to 20%, Tris-Glycine, 1.0 mm, Mini Protein Gel, 12 well	Invitrogen	XP04202BOX	use for SDS-PAGE
NuPAGE LDS Sample Buffer (x4)	Invitrogen	NP0007	use for SDS-PAGE
Optical power meter	Thorlabs (Newton, NJ, USA)	PM100	for measuring the output of the NIR laser
PBS(-)	Wako	166-23555
Pearl Trilogy imaging system	Li-Cor Biosciences		for capturing 700 nm fluorecent image
Penicilin-Streptomycin Solution (x100)	Wako	168-23191	for cell culture
Puromycin Dihydrochloride	ThermoFisher	A1113803	for luciferase transfection
RediFect Red-Fluc-Puromycin Lentiviral Prticles	PerkinElmer	CLS960002	for luciferase transfection
RPMI-1640 with L-glutamine and Phenol Red	Wako	189-02025	for cell culture
Sephadex G25 column (PD-10)	GE Healthcare (Piscataway, NJ, USA)	17-0851-01	use for conjugation of IR700
UV-1900i	Shimadzu		for measuring the APC concentration