通过甲基异硫清除和三D成像探索脂肪组织结构
1Université Côte d’Azur,Inserm UMR1065, C3M, Team “Cellular and Molecular Pathophysiology of Obesity”, Nice, France, 2Integrated Cardio Metabolic Center, Department of Medicine,Karolinska Institutet, Stockholm, Sweden, 3Université Côte d’Azur,Inserm UMR1065, C3M, Team “Haematometabolism in Diseases”, Nice, France, 4Institut de Pharmacologie et de Biologie Structurale (IPBS),Université de Toulouse, CNRS, UPS, Toulouse, France
Summary
在这里，我们描述了一种简单、廉价和快速的清除方法，通过荧光成像，使用标记的组合来可视化血管、核、免疫细胞、神经元和脂滴涂层蛋白，从而解析小鼠和人类白色脂肪组织的 3D 结构。
Abstract
肥胖是一个主要的全球公共卫生问题，增加了患心血管疾病、2型糖尿病和肝病的风险。肥胖症的特点是脂肪组织 （AT） 质量增加，由于脂肪细胞增生和/或肥大，导致其三维结构的深刻重塑。事实上，在肥胖期间，AT的最大扩张能力对于肥胖相关病理学的发展至关重要。这种 AT 膨胀是一种重要的恒向机制，能够适应过多的能量摄入，并避免有害脂质溢出到其他代谢器官，如肌肉和肝脏。因此，了解导致 AT 扩展失败的结构重塑是临床适用性高的根本问题。在这篇文章中，我们描述了一种简单而快速的清除方法，在我们的实验室中经常使用这种方法，通过荧光成像来探索小鼠和人类白色脂肪组织的形态。这种优化的AT清除方法在任何配备化学罩、温度控制轨道摇床和荧光显微镜的标准实验室中都很容易实现。此外，使用的化合物是现成的。重要的是，此方法允许人们通过染色各种标记来专门可视化腺细胞、神经元和血管网络以及先天和自适应免疫细胞分布来解析 3D AT 结构。
Introduction
肥胖症的特点是脂肪组织质量增加，并已成为一个重大的全球公共卫生问题，因为肥胖者患心血管疾病、2型糖尿病、肝病和一些癌症的风险增加。
脂肪组织的基本生理功能是调节全身葡萄糖和脂质平衡1，2。1,在喂养期间，脂肪细胞（即脂肪组织的主要细胞）将膳食提供的葡萄糖和脂质的过量储存到甘油三酯中。在禁食过程中，脂肪细胞将甘油三酯分解成非酯化脂肪酸和甘油，以维持身体的能量需求。在肥胖症的发育过程中，脂肪组织通过增加脂肪细胞的大小（肥大）和/或（增生）数量来扩大脂肪细胞1，以增加其储存能力。当脂肪组织的膨胀达到其极限时，患者中一个恒定的极易变量，剩余的脂质会积聚到其他代谢器官，包括肌肉和肝脏3、4，4导致其功能衰竭，并引发肥胖相关的心代谢并发症1,1，5。因此，确定控制脂肪组织扩张的机制是临床的关键挑战。
肥胖期间在脂肪组织内记录的形态修饰与其病理功能障碍有关。一些染色程序已经被用来描述脂肪组织的组织，包括行为素6，血管标记7，脂滴标记8，和特定的免疫细胞标记9,9，10。然而，由于脂肪细胞（50至200μm）的巨大直径11，因此必须从三维分析整个组织的很大一部分，以便准确分析肥胖期间观察到的戏剧性的结构 AT 变化。然而，由于光线不穿透不透明组织，因此不可能使用荧光显微镜在大型组织样本中进行3D成像。组织清除方法，使其透明已经报告在文献（审查，见12），允许一个人清除组织，并执行深入，整个组织荧光显微镜。这些方法为评估健康和患病组织中的 3D 细胞组织提供了前所未有的机会。每种描述的方法都有优点和缺点，因此需要根据所研究的组织仔细选择（如要回顾，见13）。事实上，有些方法需要长时间的潜伏期和/或使用昂贵,、有毒或难以获得的材料或化合物，例如14、15、16、17、18、19。,1516,17,18,19利用一个世纪前沃纳·斯帕尔特霍尔茨（Werner Spalteholz）用于清除组织20的第一批化合物之一，我们建立了一个用户友好且价格低廉的协议，非常适用于清除任何实验室中所有小鼠和人类脂肪组织库，这些实验室具有典型的设备，包括化学罩、温度控制轨道摇床和共生显微镜。
Protocol
该协议已经过测试，并验证了所有小鼠和人类白色脂肪组织库。人类和小鼠脂肪组织是根据欧洲法律收集的，并经法国和瑞典伦理委员会批准。 1. 小鼠和人类白色脂肪组织的固定 将收获的小鼠或人类白色脂肪组织浸入至少 10 mL 的 PBS 中，其中含有 4% 的甲醛 （PFA） 在 15 mL 塑料管中。 在室温下在滚动板上摇动塑料管 1 小时。 将塑料管在 4°C 下放在滚动?…
Representative Results
使用此处描述和图1 中总结的程序，我们能够分别对图2A 和图 2B中所示的人类和小鼠白色脂肪组织进行污渍和光学清除。清除的组织被转移到金属成像室进行共体成像（图3A）。清除极大地改善了我们能够获取的组织图像的深度（图3B和图3C）。使用 4 倍目标（参?…
Discussion
脂肪组织内在病理进展过程中发生的改变，如肥胖，对于理解病理背后的机制至关重要。揭示脂肪组织中这种机制的开创性研究基于全球方法，如全脂肪组织蛋白质组学21、流细胞学,22、23和转录组学24、25。,2522此外，还利用组织,学分析26、27、28、29，,<sup c…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了 INSERM 的支持， 蔚蓝海岸大学，以及法国国家研究机构（ANR）通过未来实验室信号投资（ANR-11-LABX-0028-01）的资助，通过第2学院”Systémes复合体”和学院4″复杂与多样性”项目UCA JEDI（ANR-15-IDEX-01） Médical基金会（+quipe FRM DEQ20180839587）和J.G.青年调查员计划（ANR18-CE14-0035-01-GILLERON）。我们还感谢由阿尔卑斯海洋局和Région PACA委员会资助的C3M成像核心设施，该设施也得到IBISA显微镜和成像平台Céte d’Azur（MICA）的支持。我们感谢马里恩·杜索在组织准备方面提供的技术帮助。我们感谢艾比·卡特里斯，UCA国际科学能见度，为手稿的校对阅读。
Materials
| 1.5 mL microtubes | Eppendorff tubes – Dutscher | 33528 | |
| 15 mL plastic tubes | Falcon tubes – Dutscher | 352096 | |
| 18 mm round glass coverslip | Mariendfeld | 0117580 | |
| 20 mL glass bottle | Wheaton | 986546 | |
| anti-mouse-alexa647-conjugated antibody | Jackson ImmunoResearch | 715-605-150 | Dilution: 1/100 |
| anti-rabbit-alexa647-conjugated antibody | Jackson ImmunoResearch | 711-605-152 | Dilution: 1/100 |
| BSA | Sigma-aldrich | A6003 | |
| CD301-PE antibody | Biolegend | BLE145703 | Dilution: 1/100 |
| CD31 antibody | AbCam | ab215912 | Dilution: 1/50 |
| Commercial 3D analysis software – IMARIS | Oxford instrument | with Cell module | |
| Confocal microscope – Nikon A1R | Nikon | ||
| Dapi | ThermoFisher | D1306 | Stock Concentration: 5 mg/mL; dilution 1/1000 |
| Deoxycholate | Sigma-aldrich | D6750 | |
| DMSO | Sigma-aldrich | D8418 | |
| Glut4 antibody | Santa Cruz | sc-53566 | Dilution: 1/50 |
| Glycine | Sigma-aldrich | G7126 | |
| Lectin-DyLight649 | Vector Lab | DL-1178-1 | Stock Concentration : 2 µg/µL; IV Injection: 50 µL/mice |
| Metallic imaging chamber equipped with glass bottom – AttoFluor Chamber | Thermofisher | A7816 | |
| Methyl salicylate | Sigma-aldrich | M6752 | |
| Perilipin antibody | Progen | 651156 | Dilution: 1/50 |
| Phalloidin-alexa488 | ThermoFisher | A12379 | Dilution: 1/100 |
| TCR-β-PB antibody | Biolegend | BLE109225 | Dilution: 1/100 |
| TH antibody | AbCam | ab112 | Dilution: 1/50 |
| Triton X100 | Sigma-aldrich | X100 | |
| Tween-20 | Sigma-aldrich | P416 |
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Citer Cet Article
Gilleron, J., Meziat, C., Sulen, A., Ivanov, S., Jager, J., Estève, D., Muller, C., Tanti, J., Cormont, M. Exploring Adipose Tissue Structure by Methylsalicylate Clearing and 3D Imaging. J. Vis. Exp. (162), e61640, doi:10.3791/61640 (2020).