بروتوكول حقن الدهون لقياسات البلورات التسلسلية في السنكروترون الأسترالي
Summary
والهدف من هذا البروتوكول هو توضيح كيفية إعداد عينات البلورات التسلسلية لجمع البيانات على حاقن لزج عالي، هو Lipidico، الذي تم تكليفه مؤخراً في السنكروترون الأسترالي.
Abstract
وقد تم إنشاء مرفق لإجراء قياسات البلورات التسلسلية في السنكروترون الأسترالي. يتضمن هذا المرفق غرضًا بني حاقنًا عالي اللزوجة، Lipidico، كجزء من خط شعاع البلورات الجزيئية (MX2) لقياس أعداد كبيرة من البلورات الصغيرة في درجة حرارة الغرفة. والهدف من هذه التقنية هو تمكين بلورات من أن تزرع / تنقل إلى المحاقن الزجاجية لاستخدامها مباشرة في حاقن لجمع البيانات البلورية المسلسل. وتشمل مزايا هذا الحقن القدرة على الاستجابة بسرعة للتغيرات في معدل التدفق دون انقطاع من تيار. توجد عدة قيود لهذا اللزوجة العالية عن طريق الحقن (HVI) والتي تتضمن تقييداً على اللزوجات العينة المسموح بها إلى >10 Pa.s. يمكن أن يكون استقرار الدفق أيضاً مشكلة اعتماداً على خصائص معينة من العينة. ويرد هنا بروتوكول مفصل لكيفية إعداد العينات وتشغيل حاقن لقياسات البلورات التسلسلية في السنكروترون الأسترالي. توضح الطريقة إعداد العينة، بما في ذلك نقل بلورات الليسوزيم إلى وسائط لزجة عالية (شحم السيليكون)، وتشغيل حاقن لجمع البيانات في MX2.
Introduction
البلورات التسلسلية (SX) هي تقنية تم تطويرها في البداية في سياق أشعة إكس ليزر الإلكترون الحر (XFELs)1،2،3،4. على الرغم من أن النهج المستهدفة الثابتة يمكن استخدامها لSX5،6،7، وعادة ما تستخدم أنظمة الحقن لتقديم بلورات في تيار مستمر لشعاع الأشعة السينية. لأنه يجمع بين البيانات من عدد كبير من البلورات، SX يتجنب الحاجة إلى أي محاذاة البلورية أثناء التجربة، وتمكن من جمع البيانات في درجة حرارة الغرفة8،9. مع المعونة من حاقن مناسب، يتم تدفق بلورات واحدا تلو الآخر في منطقة التفاعل الأشعة السينية ويتم جمع البيانات الناتجة عن حيود على كاشف المنطقة9،10. حتى الآن، وقد SX ناجحة في حل عدد من الهياكل البروتين1،11،12،13 بما في ذلك بلورات صغيرة جدا لقياس استخدام البلورات التقليدية. كما قدم رؤى جديدة في الديناميات الجزيئية التي تم حلها في الوقت من خلال استغلال مدة نبض الفيمتو ثانية من XFEL. من خلال بدء ردود الفعل مضخة التحقيق مع مصادر الليزر البصرية، وقد أجريت دراسات متعمقة على photosystem الثاني14،15، الضوئية البروتين الأصفر16،17، cytochrome C oxidase18، وكذلك bacteriorhodopsin19،20،21. وقد بحثت هذه الدراسات ديناميات نقل الإلكترون التي تحدث بعد تنشيط الضوء مما يدل على الإمكانات الكبيرة للبلورات المسلسل لفهم العمليات البيولوجية التي تم حلها زمنيا.
تطور البلورات التسلسلية كما أصبحت سائدة على نحو متزايد في مصادر السنكروترون9،12،20،22،23،24. السنكروترون المستندة SX يسمح لأعداد كبيرة من بلورات الفردية أن تقاس بكفاءة في درجة حرارة الغرفة باستخدام نظام الحقن المناسب. هذا النهج هو مناسبة لبلورات أصغر، وبالتالي، بالإضافة إلى أن تتطلب جهاز الكشف بسرعة معدل الإطار لجمع البيانات، مطلوب أيضا شعاع التركيز الجزئي. بالمقارنة مع البلورات التقليدية، لا ينطوي SX على تركيب ومحاذاة البلورات الفردية في شعاع الأشعة السينية. ونظراً لأن البيانات المستمدة من عدد كبير من البلورات الفردية قد تم دمجها، فإن جرعة الإشعاع التي تتلقاها كل بلورة يمكن أن تنخفض بدرجة كبيرة مقارنة بأشعة الكريستال التقليدية. ويمكن أيضاً تطبيق السنكروترون SX على دراسة ردود الفعل التي تم حلها من وقت إلى نظام ميلي ثانية، شريطة أن يتوفر جهاز كشف بمعدل إطار مرتفع بما فيه الكفاية (على سبيل المثال، 100 هرتز أو أكثر). وقد أجريت العديد من التجارب البلورية التسلسلية في السنكروترون باستخدام الحقن التي وضعت في البداية في XFEL مصادر20,22,23. النوعان الأكثر شيوعا من حاقن هي فوهة الغاز الحيوي الظاهري (GDVN)25 و حاقن اللزوجة العالية (HVI)9,24,26,27,28. وGDVN مثالية لحقن اللزوجة المنخفضة، والعينات السائلة، ولكن يتطلب معدلات تدفق عالية لتحقيق تيارات مستقرة، مما يؤدي بدوره إلى ارتفاع معدلات الاستهلاك العينة. وعلى النقيض من ذلك، HVI هي مناسبة لعينات اللزوجة العالية التي تسمح توليد تيار مستقر بمعدلات تدفق أقل بكثير، مما يؤدي إلى استهلاك عينة أقل بكثير. ولذلك، فإن حقن HVI يفضل تسليم العينات حيث الناقل اللزوج هو الأفضل (على سبيل المثال، القائم على الدهون للبروتينات غشاء) و / أو كميات كبيرة من العينة غير متوفرة. حاقن SX عموما صعبة لاستخدام وتتطلب تدريبا مكثفا للعمل. كما أنها تنطوي على بروتوكولات طويلة لنقل العينات، حيث أن العينة تحتاج إلى تحميل في خزان متخصص، وهذا عموما لديه مخاطر عالية المرتبطة به من العينة التي فقدت إما في “الحجم الميت” أو عن طريق التسرب في الاتصالات. ولذلك، من المستحسن تحسين تصميم الحقن للتخفيف من أي خسائر قبل وصول العينة إلى شعاع الأشعة السينية.
في الآونة الأخيرة، نشرت أول نتائج SX باستخدام Lipidico23 مع هدف lysozyme، وذلك باستخدام كاشف Eiger 16M. يحد تصميم الحقن هذا من هدر العينات عن طريق تقليل عدد الخطوات التي ينطوي عليها الانتقال من التبلور الأولي إلى نقل البلورات إلى الحقن متبوعًا بتسليم العينة إلى شعاع الأشعة السينية. تصف هذه المخطوطة وتوضح عملية نقل العينة بدءاً من إعداد العينة، والانتقال إلى عملية الحقن، وأخيراً جمع البيانات، باستخدام نفس وعاء التبلور. كما وصف عملية حاقن.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد تم تطوير HVI بديل، مثالية لتنفيذ تجارب SX في مصادر السنكروترون. لديها ميزتين رئيسيتين على HVIs القائمة. أولا، فمن السهل لتثبيت على خط شعاع السماح التبديل السريع بين البلورات التقليدية و SX، مطلوب فقط ~ 30 دقيقة للتركيب والمحاذاة على MX2. ثانياً، يمكن استخدام الحقن العينة المستخدمة في زراعة الب…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعم هذا العمل مركز التميز في التصوير الجزيئي المتقدم التابع لمجلس البحوث الأسترالي (CE140100011) (http://www.imagingcoe.org/). وقد أُجري هذا البحث جزئيا باستخدام خط الشعاع MX2 في السنكروترون الأسترالي، وهو جزء من منظمة أنستو، واستخدم كاشف المؤسسة الأسترالية لأبحاث السرطان.
Materials
| Hen eggwhite lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | Used to grow crystals for testing the injector and the crystals are transferred into silicon grease. https://www.sigmaaldrich.com/ |
| High vacuum silicon grease | Dow Corning | Z273554-1EA | Used for testing of injector. https://www.sigmaaldrich.com/ |
| Injector needle (108 µm ID) | Hamilton | part No: 7803-05 | www.hamiltoncompany.com |
| Glass gas-tight syringes, 100 µl | Hamilton | part no: 7656-01 | Syringes used for sample injection. www.hamiltoncompany.com |
| LCP syringe coupler | Formulatrix | 209526 | Syringe coupler to mix the samples |
| Lipidico injector | La Trobe Univerity/ANSTO | This is a specific piece of equipment that can be accessed through La Trobe University / ANSTO Australian Synchrotron Facility |
References
- Boutet, S., et al. High-resolution protein structure determination by serial femtosecond crystallography. Science. 337 (6092), 362-364 (2012).
- Spence, J. C. H., Weierstall, U., Chapman, H. N. X-ray lasers for structural and dynamic biology. Reports on Progress in Physics. 75 (10), 102601 (2012).
- Aquila, A., et al. Time-resolved protein nanocrystallography using an X-ray free-electron laser. Optics Express. 20 (3), 2706-2716 (2012).
- Schlichting, I. Serial femtosecond crystallography: the first five years. International Union of Crystallography. 2, 246-255 (2015).
- Lee, D., et al. Nylon mesh-based sample holder for fixed-target serial femtosecond crystallography. Scientific Reports. 9, 6971 (2019).
- Martin, A. V., et al. Fluctuation X-ray diffraction reveals three-dimensional nanostructure and disorder in self-assembled lipid phases. Communications Materials. 1 (1), 1-8 (2020).
- Roedig, P., et al. High-speed fixed-target serial virus crystallography. Nature Methods. 14 (8), 805 (2017).
- Chapman, H. N., et al. Femtosecond X-ray protein nanocrystallography. Nature. 470 (7332), 73-81 (2011).
- Weierstall, U., et al. Lipidic cubic phase injector facilitates membrane protein serial femtosecond crystallography. Nature Communications. 5, 3309 (2014).
- Weierstall, U. Liquid sample delivery techniques for serial femtosecond crystallography. Philosophical Transactions of the Royal Society B-Biological Sciences. 369 (1647), 20130337 (2014).
- Gati, C., et al. Atomic structure of granulin determined from native nanocrystalline granulovirus using an X-ray free-electron laser. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (9), 2247-2252 (2017).
- Nam, K. H. Sample delivery media for serial crystallography. International Journal of Molecular Sciences. 20 (5), 1094 (2019).
- Batyuk, A., et al. Native phasing of x-ray free-electron laser data for a G protein-coupled receptor. Science Advances. 2 (9), 1600292 (2016).
- Kern, J., et al. Structures of the intermediates of Kok’s photosynthetic water oxidation clock. Nature. 563 (7731), 421 (2018).
- Suga, M., et al. An oxyl/oxo mechanism for oxygen-oxygen coupling in PSII revealed by an x-ray free-electron laser. Science. 366 (6463), 334-338 (2019).
- Tenboer, J., et al. Time-resolved serial crystallography captures high-resolution intermediates of photoactive yellow protein. Science. 346 (6214), 1242-1246 (2014).
- Pande, K., et al. Femtosecond structural dynamics drives the trans/cis isomerization in photoactive yellow protein. Science. 352 (6286), 725-729 (2016).
- Ishigami, I., et al. Snapshot of an oxygen intermediate in the catalytic reaction of cytochrome c oxidase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (9), 3572-3577 (2019).
- Nango, E., et al. A three-dimensional movie of structural changes in bacteriorhodopsin. Science. 354 (6319), 1552-1557 (2016).
- Nogly, P., et al. Lipidic cubic phase serial millisecond crystallography using synchrotron radiation. International Union of Crystallography. 2, 168-176 (2015).
- Nogly, P., et al. Retinal isomerization in bacteriorhodopsin captured by a femtosecond x-ray laser. Science. 361 (6398), (2018).
- Martin-Garcia, J. M., et al. Serial millisecond crystallography of membrane and soluble protein microcrystals using synchrotron radiation. International Union of Crystallography. 4, 439-454 (2017).
- Berntsen, P., et al. The serial millisecond crystallography instrument at the Australian Synchrotron incorporating the “Lipidico” injector. Review of Scientific Instruments. 90 (8), 085110 (2019).
- Botha, S., et al. Room-temperature serial crystallography at synchrotron X-ray sources using slowly flowing free-standing high-viscosity microstreams. Acta Crystallographica Section D-Structural Biology. 71, 387-397 (2015).
- DePonte, D. P., Nass, K., Stellato, F., Liang, M., Chapman, H. N., Tschentscher, T., Cocco, D. Sample injection for pulsed X-ray sources. Advances in X-Ray Free-Electron Lasers: Radiation Schemes, X-Ray Optics, and Instrumentation: Proceedings of Society of Photo-Optical Instrumentation Engineers. , 8078 (2011).
- Park, S. Y., Nam, K. H. Sample delivery using viscous media, a syringe andasyringe pump for serial crystallography. Journal of Synchrotron Radiation. 26, 1815-1819 (2019).
- Shimazu, Y., et al. High-viscosity sample-injection device for serial femtosecond crystallography at atmospheric pressure. Journal of Applied Crystallography. 52, 1280-1288 (2019).
- Kovacsova, G., et al. Viscous hydrophilic injection matrices for serial crystallography. International Union of Crystallography. 4, 400-410 (2017).
- Darmanin, C., et al. Protein crystal screening and characterization for serial femtosecond nanocrystallography. Scientific Reports. 6, 25345 (2016).
- Conrad, C. E., et al. A novel inert crystal delivery medium for serial femtosecond crystallography. International Union of Crystallography. 2, 421-430 (2015).
- Sugahara, M., et al. Grease matrix as a versatile carrier of proteins for serial crystallography. Nature Methods. 12 (1), 61-63 (2015).
- Sugahara, M., et al. Oil-free hyaluronic acid matrix for serial femtosecond crystallography. Scientific Reports. 6, 24484 (2016).
- Fromme, R., et al. Serial femtosecond crystallography of soluble proteins in lipidic cubic phase. International Union of Crystallography. 2, 545-551 (2015).
- Ishchenko, A., Cherezov, V., Liu, W. Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography. Journal of Visualized Experiments. (115), e54463 (2016).
- Liu, W., Ishchenko, A., Cherezov, V. Preparation of microcrystals in lipidic cubic phase for serial femtosecond crystallography. Nature Protocols. 9 (9), 2123-2134 (2014).
- Hadian-Jazi, M., et al. A peak-finding algorithm based on robust statistical analysis in serial crystallography. Journal of Applied Crystallography. 50, 1705-1715 (2017).
- Kong, F. W., Yuan, L., Zheng, Y. F., Chen, W. D. Automatic Liquid Handling for Life Science: A critical review of the current state of the art. Journal of Laboratory Automation. 17 (3), 169-185 (2012).
