Het doel van dit protocol is om te demonstreren hoe seriële kristallografiemonsters kunnen worden voorbereid voor het verzamelen van gegevens op een hoge stroperige injector, Lipidico, onlangs in opdracht van de Australische synchrotron.
In het Australische synchrotron is een faciliteit ontwikkeld voor het uitvoeren van seriële kristallografiemetingen. Deze faciliteit bevat een speciaal gebouwde hoge viskeuze injector, Lipidico, als onderdeel van de macromoleculaire kristallografie (MX2) beamline om grote aantallen kleine kristallen bij kamertemperatuur te meten. Het doel van deze techniek is om kristallen te laten groeien/overbrengen naar glazen spuiten om direct in de injector te worden gebruikt voor het verzamelen van seriële kristallografiegegevens. De voordelen van deze injector zijn onder andere het vermogen om snel te reageren op veranderingen in het debiet zonder onderbreking van de stroom. Er bestaan verschillende beperkingen voor deze hoge viscositeitsinjector (HVI), waaronder een beperking van de toegestane monsterviscositeiten tot >10 Pa.s. Streamstabiliteit kan ook een probleem zijn, afhankelijk van de specifieke eigenschappen van het monster. Een gedetailleerd protocol voor het instellen van monsters en het bedienen van de injector voor seriële kristallografiemetingen bij de Australische synchrotron wordt hier gepresenteerd. De methode toont de bereiding van het monster aan, met inbegrip van de overdracht van lysozymekristallen in een hoog viskeuze medium (siliconenvet) en de werking van de injector voor het verzamelen van gegevens bij MX2.
Seriële kristallografie (SX) is een techniek die oorspronkelijk werd ontwikkeld in de context van röntgenvrije elektronenlasers (XFELs)1,2,3,4. Hoewel vaste doelbenaderingen kunnen worden gebruikt voor SX5,6,7, worden injectorsystemen meestal gebruikt om kristallen in een continue stroom naar de röntgenstraal te leveren. Omdat het gegevens van een groot aantal kristallen combineert, vermijdt SX de noodzaak van kristaluitlijning tijdens het experiment en maakt het mogelijk gegevens te verzamelen bij kamertemperatuur8,9. Met behulp van een geschikte injector worden de kristallen één voor één in het röntgeninteractiegebied gestreamd en worden de resulterende diffractiegegevens verzameld op een gebiedsdetector9,10. Tot op heden is SX succesvol geweest in het oplossen van een aantal eiwitstructuren1,11,12,13, waaronder kristallen die te klein zijn om te meten met behulp van conventionele kristallografie. Het heeft ook nieuwe inzichten gegeven in de tijd-opgeloste moleculaire dynamiek door gebruik te maken van de femtoseconde pulsduur van de XFEL. Door pompsondereacties met optische laserbronnen te initiëren, zijn diepgaande studies uitgevoerd naar fotosysteem II14,15, fotoactief geel eiwit16,17, cytochroom C oxidase18, evenals bacteriorhodopsin19,20,21. Deze studies hebben de elektronenoverdrachtsdynamiek onderzocht die optreedt na lichtactivering die het significante potentieel van seriële kristallografie aantoont voor het begrijpen van tijdgeopgeleerde biologische processen.
De ontwikkeling van seriële kristallografie komt ook steeds vaker voor bij synchrotronbronnen9,12,20,22,23,24. Synchrotron gebaseerde SX maakt het mogelijk om grote aantallen individuele kristallen efficiënt te meten bij kamertemperatuur met behulp van een geschikt injectorsysteem. Deze aanpak is geschikt voor kleinere kristallen, dus naast het vereisen van een snelle framesnelheidsdetector om de gegevens te verzamelen, is ook een micro-gerichte straal vereist. In vergelijking met conventionele kristallografie omvat SX niet de montage en uitlijning van individuele kristallen in de röntgenstraal. Omdat gegevens van een groot aantal individuele kristallen worden samengevoegd, kan de stralingsdosis die elk kristal ontvangt aanzienlijk worden verlaagd in vergelijking met conventionele kristallografie. Synchrotron SX kan ook worden toegepast op de studie van tijdgeopgeleerde reacties, zelfs tot aan het milliseconderegime, op voorwaarde dat er een detector met een voldoende hoge framesnelheid beschikbaar is (bijv. 100 Hz of meer). In het synchrotron zijn verschillende seriële kristallografie-experimenten uitgevoerd met behulp van injectoren die aanvankelijk werden ontwikkeld bij XFEL-bronnen20,22,23. De twee meest voorkomende typen injectoren zijn de Gas Dynamic Virtual Nozzle (GDVN)25 en High Viscous Injector (HVI)9,24,26,27,28. De GDVN is ideaal voor het injecteren van lage viscositeit, vloeibare monsters, maar vereist hoge debieten om stabiele stromen te bereiken, wat op zijn beurt leidt tot hoge monsterverbruikspercentages. HVI’s zijn daarentegen geschikt voor monsters met een hoge viscositeit, waardoor een stabiele stroom met veel lagere stroomsnelheden kan worden genereren, wat leidt tot een veel lager monsterverbruik. De HVI-injector geeft daarom de voorkeur aan de levering van monsters waarbij een viskeuze drager de voorkeur heeft (bijv. lipide op basis van membraaneiwitten) en/of grote hoeveelheden monster niet beschikbaar zijn. SX-injectoren zijn over het algemeen uitdagend in gebruik en vereisen uitgebreide training om te werken. Ze omvatten ook lange protocollen voor monsteroverdracht, omdat het monster in een gespecialiseerd reservoir moet worden geladen, dit heeft over het algemeen een hoog risico dat het monster verloren gaat in het ‘dode volume’ of via lekkages in de verbindingen. Daarom is het wenselijk om het ontwerp van de injector te optimaliseren om eventuele verliezen te beperken voordat het monster de röntgenstraal bereikt.
Onlangs werden de eerste SX-resultaten gepubliceerd met Lipidico23 met een lysozyme-doel, met behulp van een Eiger 16M-detector. Dit injectorontwerp beperkt de verspilling van monsters door het aantal stappen te minimaliseren dat nodig is om van de eerste kristallisatie naar de overdracht van kristallen naar de injector te gaan, gevolgd door de levering van monster aan de röntgenstraal. Dit manuscript beschrijft en demonstreert de procedure voor monsteroverdracht vanaf de monstervoorbereiding, de overgang naar het injectieproces en ten slotte het verzamelen van gegevens met behulp van hetzelfde kristallisatievat. De werking van de injector wordt ook beschreven.
Er is een alternatieve HVI ontwikkeld, ideaal voor het uitvoeren van SX-experimenten bij synchrotronbronnen. Het heeft twee belangrijke voordelen ten opzichte van bestaande HCI’s. Ten eerste is het eenvoudig te installeren op de straallijn waardoor snel kan worden geschakeld tussen conventionele kristallografie en SX, slechts ~ 30 minuten is vereist voor installatie en uitlijning op MX2. Ten tweede kunnen de monsterspuiten die worden gebruikt om kristallen te kweken, rechtstreeks worden gebruikt als reservoirs voor injec…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door het Australian Research Council Centre of Excellence in Advanced Molecular Imaging (CE140100011) (http://www.imagingcoe.org/). Dit onderzoek werd deels uitgevoerd met behulp van de MX2 beamline bij het Australische Synchrotron, onderdeel van ANSTO, en maakte gebruik van de Australian Cancer Research Foundation (ACRF) detector.
Hen eggwhite lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | Used to grow crystals for testing the injector and the crystals are transferred into silicon grease. https://www.sigmaaldrich.com/ |
High vacuum silicon grease | Dow Corning | Z273554-1EA | Used for testing of injector. https://www.sigmaaldrich.com/ |
Injector needle (108 µm ID) | Hamilton | part No: 7803-05 | www.hamiltoncompany.com |
Glass gas-tight syringes, 100 µl | Hamilton | part no: 7656-01 | Syringes used for sample injection. www.hamiltoncompany.com |
LCP syringe coupler | Formulatrix | 209526 | Syringe coupler to mix the samples |
Lipidico injector | La Trobe Univerity/ANSTO | This is a specific piece of equipment that can be accessed through La Trobe University / ANSTO Australian Synchrotron Facility |