Protocolo de inyección lipídica para mediciones de cristalografía en serie en el sincrotrón australiano
Summary
El objetivo de este protocolo es demostrar cómo preparar muestras de cristalografía en serie para la recopilación de datos en un inyector viscoso alto, Lipidico, recientemente encargado en el sincrotrón australiano.
Abstract
Se ha desarrollado una instalación para realizar mediciones de cristalografía en serie en el sincrotrón australiano. Esta instalación incorpora un inyector de alto viscoso construido específicamente, Lipidico, como parte de la línea de haz de cristalografía macromolecular (MX2) para medir un gran número de pequeños cristales a temperatura ambiente. El objetivo de esta técnica es permitir que los cristales se cultieran/transfieran a jeringas de vidrio para ser utilizados directamente en el inyector para la recopilación de datos de cristalografía en serie. Las ventajas de este inyector incluyen la capacidad de responder rápidamente a los cambios en el caudal sin interrupción de la corriente. Existen varias limitaciones para este inyector de alta viscosidad (HVI) que incluyen una restricción a las viscosidades de muestra permitidas a >10 Pa.s. La estabilidad de la secuencia también puede ser un problema en función de las propiedades específicas del ejemplo. Aquí se presenta un protocolo detallado sobre cómo configurar muestras y utilizar el inyector para mediciones de cristalografía en serie en el sincrotrón australiano. El método demuestra la preparación de la muestra, incluyendo la transferencia de cristales de liozima a un medio viscoso alto (grasa de silicona), y el funcionamiento del inyector para la recolección de datos en MX2.
Introduction
La cristalografía en serie (SX) es una técnica que se desarrolló inicialmente en el contexto de láseres electrónicos libres de rayos X (XFELs)1,2,3,4. Aunque los enfoques de destino fijos se pueden utilizar para SX5,6,7, normalmente, los sistemas de inyectores se emplean para entregar cristales en un flujo continuo al haz de rayos X. Debido a que combina datos de un gran número de cristales, SX evita la necesidad de cualquier alineación de cristal durante el experimento, y permite recopilar datos a temperatura ambiente8,9. Con la ayuda de un inyector adecuado, los cristales se transmiten uno por uno en el área de interacción de rayos X y los datos de difracción resultantes se recogen en un detector de área9,10. Hasta la fecha, SX ha tenido éxito en la resolución de una serie de estructuras proteicas1,11,12,13 incluyendo cristales demasiado pequeños para medir utilizando cristalografía convencional. También ha proporcionado nuevos conocimientos sobre la dinámica molecular resuelta en el tiempo mediante la explotación de la duración del pulso femtosegundo de la XFEL. Al iniciar reacciones bomba-sonda con fuentes láser ópticas, se han realizado estudios en profundidad en el fotosistema II14,15,proteína amarilla fotoactiva16,17,citocromo C oxidasa18,así como bacteriorhodopsina19,20,21. Estos estudios han sondeado la dinámica de transferencia de electrones que se produce después de la activación de la luz que demuestra el potencial significativo de la cristalografía en serie para comprender los procesos biológicos resueltos por el tiempo.
El desarrollo de la cristalografía en serie también es cada vez más frecuente en las fuentes de sincrotrón9,12,20,22,23,24. SX basado en sincrotrón permite medir un gran número de cristales individuales eficientemente a temperatura ambiente utilizando un sistema de inyector adecuado. Este enfoque es adecuado para cristales más pequeños, por lo tanto, además de requerir un detector rápido de velocidad de fotogramas para recopilar los datos, también se requiere un haz microenfoque. En comparación con la cristalografía convencional, SX no implica el montaje y alineación de cristales individuales en el haz de rayos X. Debido a que los datos de un gran número de cristales individuales se fusionan, la dosis de radiación recibida por cada cristal se puede reducir sustancialmente en comparación con la cristalografía convencional. Synchrotron SX también se puede aplicar al estudio de reacciones resueltas en el tiempo, incluso hasta el régimen de milisegundos, siempre que haya un detector con una velocidad de fotogramas suficientemente alta (por ejemplo, 100 Hz o más). Se han llevado a cabo varios experimentos de cristalografía en serie en el sincrotrón utilizando inyectores que se desarrollaron inicialmente en fuentes XFEL20,22,23. Los dos tipos más comunes de inyector son la boquilla virtual dinámica de gas (GDVN)25 y el inyector viscoso alto (HVI)9,24,26,27,28. El GDVN es ideal para inyectar baja viscosidad, muestras líquidas, pero requiere altos caudales para lograr flujos estables, lo que a su vez conduce a altas tasas de consumo de muestras. Por el contrario, los HVI son adecuados para muestras de alta viscosidad que permiten la generación de una corriente estable a caudales mucho más bajos, lo que conduce a un consumo de muestra mucho menor. El inyector HVI, por lo tanto, favorece la entrega de muestras cuando un portador viscoso es preferible (por ejemplo, a base de lípidos para proteínas de membrana) y/o grandes cantidades de muestra no están disponibles. Los inyectores SX son generalmente difíciles de usar y requieren una amplia capacitación para operar. También implican largos protocolos de transferencia de muestras, ya que la muestra necesita ser cargada en un depósito especializado, esto generalmente tiene un alto riesgo asociado con que se pierda la muestra ya sea en el “volumen muerto” o a través de fugas en las conexiones. Por lo tanto, es deseable optimizar el diseño del inyector para mitigar cualquier pérdida antes de que la muestra llegue al haz de rayos X.
Recientemente, los primeros resultados de SX se publicaron usando Lipidico23 con un objetivo de lysozyme, utilizando un detector Eiger 16M. Este diseño del inyector limita el desperdicio de muestras al minimizar el número de pasos implicados en pasar de la cristalización inicial a la transferencia de cristales al inyector, seguido de la entrega de muestras al haz de rayos X. Este manuscrito describe y muestra el procedimiento de transferencia de muestras a partir de la preparación de la muestra, pasando al proceso de inyección y, finalmente, a la recopilación de datos, utilizando el mismo recipiente de cristalización. También se describe el funcionamiento del inyector.
Protocol
Representative Results
Discussion
Se ha desarrollado un HVI alternativo, ideal para llevar a cabo experimentos SX en fuentes sincrotrón. Tiene dos ventajas clave sobre los HVIs existentes. En primer lugar, es fácil de instalar en la línea de haz que permite el cambio rápido entre la cristalografía convencional y SX, sólo ~ 30 minutos es necesario para la instalación y alineación en MX2. En segundo lugar, las jeringas de muestra utilizadas para cultivar cristales se pueden utilizar directamente como reservorios para inyección, lo que limita el de…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por el Centro de Excelencia en Imágenes Moleculares Avanzadas (CE140100011) del Consejo Australiano de Investigación (http://www.imagingcoe.org/). Esta investigación se llevó a cabo en parte utilizando la línea de haz MX2 en el Sincrotrón Australiano, parte de ANSTO, y hizo uso del detector de la Fundación Australiana de Investigación del Cáncer (ACRF).
Materials
| Hen eggwhite lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | Used to grow crystals for testing the injector and the crystals are transferred into silicon grease. https://www.sigmaaldrich.com/ |
| High vacuum silicon grease | Dow Corning | Z273554-1EA | Used for testing of injector. https://www.sigmaaldrich.com/ |
| Injector needle (108 µm ID) | Hamilton | part No: 7803-05 | www.hamiltoncompany.com |
| Glass gas-tight syringes, 100 µl | Hamilton | part no: 7656-01 | Syringes used for sample injection. www.hamiltoncompany.com |
| LCP syringe coupler | Formulatrix | 209526 | Syringe coupler to mix the samples |
| Lipidico injector | La Trobe Univerity/ANSTO | This is a specific piece of equipment that can be accessed through La Trobe University / ANSTO Australian Synchrotron Facility |
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