Avustralya Senkrotron'da Seri Kristalografi Ölçümleri için Lipidico Enjeksiyon Protokolü
Summary
Bu protokolün amacı, yakın zamanda Avustralya senkrotronunda görevlendirilen yüksek viskoz enjektör Lipidico’da veri toplama için seri kristalografi örneklerinin nasıl hazırlanacağını göstermektir.
Abstract
Avustralya senkrotron’larında seri kristalografi ölçümleri yapmak için bir tesis geliştirilmiştir. Bu tesis, oda sıcaklığında çok sayıda küçük kristali ölçmek için makromoleküler kristalografi (MX2) kiriş hattının bir parçası olarak yüksek viskoz enjektör Lipidico’yu içerir. Bu tekniğin amacı, kristallerin seri kristalografi veri toplama için doğrudan enjektörde kullanılmak üzere cam şırınna yetiştirilmesini/aktarılmasını sağlamaktır. Bu enjektörün avantajları, akış hızının kesintiye uğramadan akış hızındaki değişikliklere hızlı bir şekilde yanıt verebilmesidir. Bu yüksek viskoziteli enjektör (HVI) için izin verilen örnek viskozitelerinin >10 Pa.s.’a sınırlandırılmasını içeren çeşitli sınırlamalar vardır. Akış kararlılığı, örneğin belirli özelliklerine bağlı olarak potansiyel olarak bir sorun olabilir. Avustralya senkrotron’larında seri kristalografi ölçümleri için numunelerin nasıl ayarlanıp enjektörün nasıl çalıştırılacağına ilişkin ayrıntılı bir protokol burada sunulmaktadır. Yöntem, lysozyme kristallerinin yüksek viskoz bir ortama (silikon gres) aktarılması ve enjektörün MX2’de veri toplama için çalışması da dahil olmak üzere numunenin hazırlanmasını göstermektedir.
Introduction
Seri kristalografi (SX), başlangıçta X-ışını Serbest Elektron Lazerleri (XFEL’ler) 1, 2,3,4bağlamında geliştirilen bir tekniktir. Sabit hedef yaklaşımları SX5,6,7için kullanılabilse de, tipik olarak, kristalleri X-ışını ışınlarına sürekli bir akışta teslim etmek için enjektör sistemleri kullanılır. Çok sayıda kristalden gelen verileri birleştirdiği için, SX deney sırasında herhangi bir kristal hizalama ihtiyacını önler ve verilerin odasıcaklığında 8,9. Uygun bir enjektör yardımıyla, kristaller X-ışını etkileşim alanına tek tek akar ve elde edilen kırınım verileri bir alan dedektörü9,10‘da toplanır. Bugüne kadar SX, geleneksel kristalografi kullanarak ölçülemeyecek kadar küçük kristaller de dahil olmak üzere1,11,12,13 protein yapılarını çözmede başarılı olmuştur. Ayrıca XFEL’in femtosaniye darbe süresinden yararlanarak zaman çözülen moleküler dinamikler hakkında yeni içgörüler sağlamıştır. Optik lazer kaynakları ile pompa probu reaksiyonları başlatılarak fotosistem II14 , 15, fotoaktif sarı protein16,17,sitokrom Coksidaz18 ve bakteriyhodopsin19,20,21üzerinde derinlemesine çalışmalar yapılmıştır. Bu çalışmalar, zaman ile çözülen biyolojik süreçleri anlamak için seri kristalografinin önemli potansiyelini gösteren ışık aktivasyonundan sonra ortaya çıkan elektron transfer dinamiklerini araştırmıştır.
Seri kristalografinin gelişimi de senkrotron kaynakları 9 , 12,20,22,23,24’tegiderek yaygınlaşmaktadır. Senkrotron bazlı SX, çok sayıda bireysel kristalin uygun bir enjektör sistemi kullanılarak oda sıcaklığında verimli bir şekilde ölçülmasını sağlar. Bu yaklaşım daha küçük kristaller için uygundur, bu nedenle verileri toplamak için hızlı bir kare hızı dedektörü gerektirmenin yanı sıra, mikro odaklı bir ışın da gereklidir. Geleneksel kristalografi ile karşılaştırıldığında, SX, X-ışını ışınındaki tek tek kristallerin montajını ve hizalamasını içermez. Çok sayıda bireysel kristalden elde edilen veriler birleştirildiğinden, her kristal tarafından alınan radyasyon dozu geleneksel kristalografiye kıyasla önemli ölçüde azaltılabilir. Synchrotron SX, yeterince yüksek kare hızına sahip bir dedektörün mevcut olması koşuluyla (örneğin, 100 Hz veya daha fazla) milisaniyelik rejime kadar zaman çözümlenmiş reaksiyonların incelenmesine de uygulanabilir. Başlangıçta XFEL kaynakları 20,22,23’tegeliştirilen enjektörlerkullanılarak senkrotronda çeşitli seri kristalografi deneyleri yapılmıştır. En yaygın iki enjektör türü Gaz Dinamik Sanal Nozül (GDVN)25 ve Yüksek Viskoz Enjektör (HVI)9, 24,26,27,28 ‘dir. GDVN, düşük viskoziteli, sıvı numuneler enjekte etmek için idealdir, ancak kararlı akışlara ulaşmak için yüksek akış hızları gerektirir ve bu da yüksek numune tüketim oranlarına yol açar. Bunun aksine, HVI’ler çok daha düşük akış hızlarında kararlı bir akış üretilmesine izin veren ve çok daha düşük numune tüketimine yol açan yüksek viskoziteli numuneler için uygundur. Bu nedenle, HVI enjektörü, viskoz bir taşıyıcının tercih edildiği (örneğin, membran proteinleri için lipid bazlı) ve / veya büyük miktarlarda numunenin bulunmadığı numunelerin teslimini tercih eder. SX enjektörlerinin kullanımı genellikle zordur ve çalışması için kapsamlı eğitim gerektirir. Ayrıca, numunenin özel bir rezervuara yüklenmesi gerektiğinden, uzun numune aktarım protokollerini de içerirler, bu genellikle numunenin ‘ölü hacimde’ veya bağlantılardaki sızıntılar yoluyla kaybolmasıyla ilişkili yüksek bir riske sahiptir. Bu nedenle, numune X-ışını ışınlarına ulaşmadan önce herhangi bir kaybı azaltmak için enjektör tasarımını optimize etmek istenir.
Son zamanlarda, ilk SX sonuçları Lipidico23 kullanılarak bir lysozyme hedefi kullanılarak, bir Eiger 16M dedektörü kullanılarak yayınlandı. Bu enjektör tasarımı, ilk kristalizasyondan kristallerin enjektöre aktarılmasına ve ardından numunenin X-ışını ışınına teslim edilmesine kadar olan adımların sayısını en aza indirerek örnek atıklarını sınırlar. Bu makale, aynı kristalizasyon kabını kullanarak numune hazırlamadan başlayarak, enjeksiyon sürecine ve son olarak veri toplama işleminden başlayarak örnek aktarım prosedürünü açıklar ve gösterir. Enjektörün çalışması da açıklanmıştır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Senkrotron kaynaklarında SX deneyleri yapmak için ideal olan alternatif bir HVI geliştirilmiştir. Mevcut HVI’lere göre iki temel avantajı vardır. İlk olarak, geleneksel kristalografi ve SX arasında hızlı geçiş sağlayan kiriş çizgisine kurulumu kolaydır, MX2’ye kurulum ve hizalama için sadece ~ 30 dakika gereklidir. İkincisi, kristal yetiştirmek için kullanılan örnek şırınnalar, numune transferi sırasında wastage’ı sınırlayarak enjeksiyon için rezervuar olarak doğrudan kullanılabilir. Ör…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Avustralya Araştırma Konseyi İleri Moleküler Görüntüleme Mükemmeliyet Merkezi (CE140100011) (http://www.imagingcoe.org/) tarafından desteklenmiştir. Bu araştırma kısmen ANSTO’nun bir parçası olan Avustralya Senkrotron’daki MX2 kiriş çizgisi kullanılarak gerçekleştirildi ve Avustralya Kanser Araştırma Vakfı (ACRF) dedektöründen yararlanıldı.
Materials
| Hen eggwhite lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | Used to grow crystals for testing the injector and the crystals are transferred into silicon grease. https://www.sigmaaldrich.com/ |
| High vacuum silicon grease | Dow Corning | Z273554-1EA | Used for testing of injector. https://www.sigmaaldrich.com/ |
| Injector needle (108 µm ID) | Hamilton | part No: 7803-05 | www.hamiltoncompany.com |
| Glass gas-tight syringes, 100 µl | Hamilton | part no: 7656-01 | Syringes used for sample injection. www.hamiltoncompany.com |
| LCP syringe coupler | Formulatrix | 209526 | Syringe coupler to mix the samples |
| Lipidico injector | La Trobe Univerity/ANSTO | This is a specific piece of equipment that can be accessed through La Trobe University / ANSTO Australian Synchrotron Facility |
References
- Boutet, S., et al. High-resolution protein structure determination by serial femtosecond crystallography. Science. 337 (6092), 362-364 (2012).
- Spence, J. C. H., Weierstall, U., Chapman, H. N. X-ray lasers for structural and dynamic biology. Reports on Progress in Physics. 75 (10), 102601 (2012).
- Aquila, A., et al. Time-resolved protein nanocrystallography using an X-ray free-electron laser. Optics Express. 20 (3), 2706-2716 (2012).
- Schlichting, I. Serial femtosecond crystallography: the first five years. International Union of Crystallography. 2, 246-255 (2015).
- Lee, D., et al. Nylon mesh-based sample holder for fixed-target serial femtosecond crystallography. Scientific Reports. 9, 6971 (2019).
- Martin, A. V., et al. Fluctuation X-ray diffraction reveals three-dimensional nanostructure and disorder in self-assembled lipid phases. Communications Materials. 1 (1), 1-8 (2020).
- Roedig, P., et al. High-speed fixed-target serial virus crystallography. Nature Methods. 14 (8), 805 (2017).
- Chapman, H. N., et al. Femtosecond X-ray protein nanocrystallography. Nature. 470 (7332), 73-81 (2011).
- Weierstall, U., et al. Lipidic cubic phase injector facilitates membrane protein serial femtosecond crystallography. Nature Communications. 5, 3309 (2014).
- Weierstall, U. Liquid sample delivery techniques for serial femtosecond crystallography. Philosophical Transactions of the Royal Society B-Biological Sciences. 369 (1647), 20130337 (2014).
- Gati, C., et al. Atomic structure of granulin determined from native nanocrystalline granulovirus using an X-ray free-electron laser. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (9), 2247-2252 (2017).
- Nam, K. H. Sample delivery media for serial crystallography. International Journal of Molecular Sciences. 20 (5), 1094 (2019).
- Batyuk, A., et al. Native phasing of x-ray free-electron laser data for a G protein-coupled receptor. Science Advances. 2 (9), 1600292 (2016).
- Kern, J., et al. Structures of the intermediates of Kok’s photosynthetic water oxidation clock. Nature. 563 (7731), 421 (2018).
- Suga, M., et al. An oxyl/oxo mechanism for oxygen-oxygen coupling in PSII revealed by an x-ray free-electron laser. Science. 366 (6463), 334-338 (2019).
- Tenboer, J., et al. Time-resolved serial crystallography captures high-resolution intermediates of photoactive yellow protein. Science. 346 (6214), 1242-1246 (2014).
- Pande, K., et al. Femtosecond structural dynamics drives the trans/cis isomerization in photoactive yellow protein. Science. 352 (6286), 725-729 (2016).
- Ishigami, I., et al. Snapshot of an oxygen intermediate in the catalytic reaction of cytochrome c oxidase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (9), 3572-3577 (2019).
- Nango, E., et al. A three-dimensional movie of structural changes in bacteriorhodopsin. Science. 354 (6319), 1552-1557 (2016).
- Nogly, P., et al. Lipidic cubic phase serial millisecond crystallography using synchrotron radiation. International Union of Crystallography. 2, 168-176 (2015).
- Nogly, P., et al. Retinal isomerization in bacteriorhodopsin captured by a femtosecond x-ray laser. Science. 361 (6398), (2018).
- Martin-Garcia, J. M., et al. Serial millisecond crystallography of membrane and soluble protein microcrystals using synchrotron radiation. International Union of Crystallography. 4, 439-454 (2017).
- Berntsen, P., et al. The serial millisecond crystallography instrument at the Australian Synchrotron incorporating the “Lipidico” injector. Review of Scientific Instruments. 90 (8), 085110 (2019).
- Botha, S., et al. Room-temperature serial crystallography at synchrotron X-ray sources using slowly flowing free-standing high-viscosity microstreams. Acta Crystallographica Section D-Structural Biology. 71, 387-397 (2015).
- DePonte, D. P., Nass, K., Stellato, F., Liang, M., Chapman, H. N., Tschentscher, T., Cocco, D. Sample injection for pulsed X-ray sources. Advances in X-Ray Free-Electron Lasers: Radiation Schemes, X-Ray Optics, and Instrumentation: Proceedings of Society of Photo-Optical Instrumentation Engineers. , 8078 (2011).
- Park, S. Y., Nam, K. H. Sample delivery using viscous media, a syringe andasyringe pump for serial crystallography. Journal of Synchrotron Radiation. 26, 1815-1819 (2019).
- Shimazu, Y., et al. High-viscosity sample-injection device for serial femtosecond crystallography at atmospheric pressure. Journal of Applied Crystallography. 52, 1280-1288 (2019).
- Kovacsova, G., et al. Viscous hydrophilic injection matrices for serial crystallography. International Union of Crystallography. 4, 400-410 (2017).
- Darmanin, C., et al. Protein crystal screening and characterization for serial femtosecond nanocrystallography. Scientific Reports. 6, 25345 (2016).
- Conrad, C. E., et al. A novel inert crystal delivery medium for serial femtosecond crystallography. International Union of Crystallography. 2, 421-430 (2015).
- Sugahara, M., et al. Grease matrix as a versatile carrier of proteins for serial crystallography. Nature Methods. 12 (1), 61-63 (2015).
- Sugahara, M., et al. Oil-free hyaluronic acid matrix for serial femtosecond crystallography. Scientific Reports. 6, 24484 (2016).
- Fromme, R., et al. Serial femtosecond crystallography of soluble proteins in lipidic cubic phase. International Union of Crystallography. 2, 545-551 (2015).
- Ishchenko, A., Cherezov, V., Liu, W. Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography. Journal of Visualized Experiments. (115), e54463 (2016).
- Liu, W., Ishchenko, A., Cherezov, V. Preparation of microcrystals in lipidic cubic phase for serial femtosecond crystallography. Nature Protocols. 9 (9), 2123-2134 (2014).
- Hadian-Jazi, M., et al. A peak-finding algorithm based on robust statistical analysis in serial crystallography. Journal of Applied Crystallography. 50, 1705-1715 (2017).
- Kong, F. W., Yuan, L., Zheng, Y. F., Chen, W. D. Automatic Liquid Handling for Life Science: A critical review of the current state of the art. Journal of Laboratory Automation. 17 (3), 169-185 (2012).
