न्यूरॉन्स के लिए विविध सिनैप्टिक आदानों का एकीकरण सबसे अच्छा एक तैयारी है कि प्राकृतिक समय और सर्किट प्लास्टिसिटी के लिए सभी पूर्व सिनैप्टिक नाभिक को बरकरार रखता है में मापा जाता है, लेकिन मस्तिष्क स्लाइस आम तौर पर कई कनेक्शन तोड़ । हमने विट्रो प्रयोग क्षमता को बनाए रखते हुए वीवो सर्किट गतिविधि में नकल करने के लिए एक संशोधित मस्तिष्क टुकड़ा विकसित किया।
इन विट्रो स्लाइस इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी तकनीक सटीक इलेक्ट्रिकल और लौकिक संकल्प के साथ एकल-कोशिका गतिविधि को मापती है। मस्तिष्क स्लाइस पैच-क्लैंपिंग या इमेजिंग के लिए न्यूरॉन्स को ठीक से कल्पना करने और एक्सेस करने के लिए अपेक्षाकृत पतला होना चाहिए, और मस्तिष्क सर्किटरी की विट्रो परीक्षा केवल तीव्र स्लाइस में शारीरिक रूप से मौजूद होने तक ही सीमित है। प्रेसिनैप्टिक नाभिक के एक बड़े हिस्से को संरक्षित करते हुए इन विट्रो स्लाइस प्रयोग के लाभों को बनाए रखने के लिए, हमने एक उपन्यास स्लाइस तैयारी विकसित की। यह “वेज स्लाइस” पैच-क्लैंप इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी रिकॉर्डिंग के लिए डिज़ाइन किया गया था ताकि ब्रेनस्टेम में मध्यम ओलिवोकोक्लियर (एमओसी) न्यूरॉन्स के लिए विविध मोनारल, ध्वनि-चालित इनपुट की विशेषता हो। इन न्यूरॉन्स को कॉन्ट्रालेट्रल कान और इसी कॉकलियर न्यूक्लियस (सीएन) में उत्तेजनाओं द्वारा सक्रिय न्यूरॉन्स से उनकी प्राथमिक अफ़ोड़क उत्तेजक और निरोधात्मक जानकारी प्राप्त होती है। एक विषम मस्तिष्क टुकड़ा डिजाइन किया गया था जो एक गोलार्द्ध के पार्श्व किनारे पर रोस्ट्रो-कौडल डोमेन में सबसे मोटा है और फिर विपरीत गोलार्द्ध के पार्श्व किनारे की ओर पतला होता है। इस टुकड़े में मोटी तरफ, श्रवण तंत्रिका पक्ष मस्तिष्क को श्रवण उत्तेजनाओं के बारे में जानकारी प्रदान करता है, आंतरिक सीएन सर्किटरी, और दोनों डिंपिटिक उत्तेजक और ट्राइसिनैप्टिक निरोधात्मक अफरेंशक रास्ते जो कॉन्ट्रालेटरल एमओसी न्यूरॉन्स पर एकाग्र होते हैं। रिकॉर्डिंग स्लाइस के पतले पक्ष पर MOC न्यूरॉन्स से की जाती है, जहां उन्हें विशिष्ट पैच-क्लैंप प्रयोगों के लिए डीआईसी ऑप्टिक्स का उपयोग करके कल्पना की जाती है। श्रवण तंत्रिका की प्रत्यक्ष उत्तेजना के रूप में यह श्रवण ब्रेनस्टेम में प्रवेश करती है, आंतरिक सीएन सर्किट गतिविधि और सिनैप्टिक प्लास्टिसिटी के लिए अनुमति देने के लिए MOC न्यूरॉन्स के ऊपर synapses पर होने के लिए किया जाता है । इस तकनीक के साथ, कोई भी स्लाइस के भीतर जितना संभव हो उतना बारीकी से वीवो सर्किट सक्रियण में नकल कर सकता है। यह वेज स्लाइस तैयारी अन्य मस्तिष्क सर्किट पर लागू होती है जहां सर्किट विश्लेषण इन विट्रो स्लाइस फिजियोलॉजी के तकनीकी फायदों के संयोजन में अपस्ट्रीम कनेक्टिविटी और लंबी दूरी के आदानों के संरक्षण से लाभान्वित होंगे।
तंत्रिका सर्किट की गतिविधि का अवलोकन आदर्श रूप से देशी संवेदी आदानों और प्रतिक्रिया के साथ किया जाता है, और वीवो में मस्तिष्क क्षेत्रों के बीच बरकरार कनेक्टिविटी। हालांकि, तंत्रिका सर्किट समारोह के एकल कोशिका संकल्प देने वाले प्रयोगों का प्रदर्शन अभी भी बरकरार मस्तिष्क में तकनीकी चुनौतियों से सीमित है। जबकि वीवो एक्सट्रासेलुलर इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी या मल्टीफोटोन इमेजिंग विधियों का उपयोग अक्षुण्ण तंत्रिका तंत्र में गतिविधि की जांच के लिए किया जा सकता है, यह व्याख्या करते हुए कि विभिन्न इनपुट सबथ्रेसहोल्ड सिनैप्टिक इनपुट को एकीकृत या मापने के तरीके मुश्किल बने हुए हैं। वीवो पूरे सेल रिकॉर्डिंग में इन सीमाओं को दूर लेकिन प्रदर्शन करने के लिए चुनौतीपूर्ण हैं, यहां तक कि मस्तिष्क क्षेत्रों में जो आसानी से पहुँचा रहे हैं । एकल-कोशिका संकल्प प्रयोगों की तकनीकी चुनौतियां मस्तिष्क में गहरी स्थित कुछ न्यूरॉन आबादी में या स्थानिक रूप से फैलाना आबादी में परिलक्षित होती हैं जिन्हें वीवो में कोशिकाओं का पता लगाने के लिए आनुवंशिक उपकरणों की आवश्यकता होती है (उदाहरण के लिए, ऑप्टरोड रिकॉर्डिंग के साथ जोड़े गए चैनलरहोडोप्सिन की आनुवंशिक अभिव्यक्ति) या रिकॉर्डिंग साइट लेबलिंग के बाद पोस्ट-हॉक हिस्टोकेमिकल पहचान (जैसे न्यूरोट्रांसमिशन-विशिष्ट मार्कर के साथ)। ब्रेनस्टेम की वेंट्रल सतह के पास फैला हुआ स्थित होने के नाते, औसत दर्जे के ओलिवोकोक्लियर (एमओसी) न्यूरॉन्स उपरोक्त सीमाओं1से पीड़ित हैं, जिससे उन्हें वीवो प्रयोग में उपयोग करना बेहद मुश्किल हो जाता है।
मस्तिष्क के स्लाइस (~ 100-500 माइक्रोन मोटाई) का उपयोग लंबे समय से मस्तिष्क सर्किटरी का अध्ययन करने के लिए किया जाता है, जिसमें श्रवण ब्रेनस्टेम सर्किटरी शामिल है, क्योंकि एक हीस्लाइस2,3,4,5,6,7,8, 9के भीतर निहित कनेक्टेड न्यूरॉन्स के भौतिक अलगाव के कारण। बहुत मोटे स्लाइस (>1 मिमी) का उपयोग करके प्रयोगों को अन्य प्रयोगशालाओं में नियोजित किया गया है ताकि यह समझा जा सके कि मध्यवर्ती बेहतर जैतून10, 11सहित बेहतर अल्पारी परिसर (एसओसी) के क्षेत्रों में द्विपक्षीय आदान कैसे एकीकृत होतेहैं। इन स्लाइस को इस तरह तैयार किया गया था कि श्रवण तंत्रिका (एएन) के अक्षों टुकड़े के भीतर बरकरार रहे और सीएन में सिनैप्टिक न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज शुरू करने के लिए विद्युत रूप से उत्तेजित थे, पहले आदेश श्रवण न्यूरॉन्स की गतिविधि की नकल उतारते हुए क्योंकि वे ध्वनि का जवाब देंगे। इन मोटी स्लाइस का एक प्रमुख नुकसान पैच-क्लैंप इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग (“पैचिंग”) के लिए न्यूरॉन्स की दृश्यता है। पैचिंगतेजी से मुश्किल हो जाती है क्योंकि इस क्षेत्र में कई अक्षों को12, 13, 14,15की उम्र के साथ myelinated होजाताहै, जिससे ऊतक ऑप्टिकल रूप से घने हो जाते हैं और एक विशिष्ट, पतले मस्तिष्क के टुकड़े में भी न्यूरॉन्स को अस्पष्ट कर देते हैं। हमारा लक्ष्य विट्रो तैयारी में बनाना है जो वीवो रिकॉर्डिंग में सर्किट कनेक्टिविटी के समान है, लेकिन मस्तिष्क स्लाइस में नेत्रहीन निर्देशित पैच-क्लैंप इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी की उच्च-थ्रूपुट और उच्च-रिज़ॉल्यूशन रिकॉर्डिंग क्षमताओं के साथ।
हमारी प्रयोगशाला MOC न्यूरॉन्स सहित श्रवण efferent प्रणाली के न्यूरॉन्स के शरीर विज्ञान की जांच । ये कोलिनेर्गिक न्यूरॉन्स बाहरी बाल कोशिकाओं (OHCs) 16 , 17 ,18,19,20की गतिविधि को मॉडुलन करके कॉकलियाकोप्रतिक्रिया प्रदानकरतेहैं । पिछले अध्ययनों से पता चला है कि यह मॉडुलन 21 , 22 ,23,24 ,25,26 और ध्वनिक आघात27, 28,20,30,32 ,32,33 मेंनियंत्रण प्राप्त करने में भूमिकानिभाताहै । चूहों में, एमओसी न्यूरॉन्स श्रवण ब्रेनस्टेम1में ट्रैपेजॉइड शरीर (वीटीबी) के वेंट्रल नाभिक में स्थित होते हैं। हमारे समूह ने एपीफ्लोरोसेंट रोशनी के तहत ब्रेनस्टेम स्लाइस में MOC न्यूरॉन्स को लक्षित करने के लिए tdTomato रिपोर्टर माउस लाइन के साथ पार की गई ChAT-IRES-Cre माउस लाइन का उपयोग किया है। हमने दिखाया कि एमओसी न्यूरॉन्स को ट्रैपेज़ाइड शरीर (एमएनएलबी) के इप्सिलेटरल मध्यीय नाभिक से अफरीन निरोधात्मक इनपुट प्राप्त होता है, जो बदले में, गोलाकार जंगली कोशिकाओं (जीबीसी) सेअक्षतल कॉकलियर नाभिक (सीएन)34, 35,36,37,38में एक्सॉन द्वारा उत्साहित है। इसके अतिरिक्त, एमओसी न्यूरॉन्स की संभावना को टी-स्टेलेटकोशिकाओं से कॉन्ट्रालेटल सीएन39,40,41में उनके उत्तेजक इनपुट प्राप्त होते हैं। एक साथ लिया, इन अध्ययनों से पता चलता है MOC न्यूरॉन्स दोनों उत्तेजक और निरोधात्मक एक ही (contralateral) कान से प्राप्त आदानों प्राप्त करते हैं । हालांकि, प्रेसिनैप्टिक न्यूरॉन्स, और उनके एक्सॉन MOC न्यूरॉन्स पर अभिसरण, एक ठेठ कोरोनल स्लाइस तैयारी में पूरी तरह से बरकरार होने के लिए एक दूसरे के लिए काफी करीब नहीं हैं। यह जांचने के लिए कि एमओसी न्यूरॉन्स के लिए सिनैप्टिक इनपुट का एकीकरण उनके एक्शन संभावित फायरिंग पैटर्न को कैसे प्रभावित करता है, नए वर्णित अवरोध पर ध्यान केंद्रित करने के साथ, हमने एक तैयारी विकसित की जिसमें हम सबसे शारीरिक यथार्थवादी तरीके से एक कान से MOC न्यूरॉन्स के लिए विविध afferents को उत्तेजित कर सकते हैं, लेकिन इन विट्रो ब्रेन स्लाइस प्रयोगों के तकनीकी लाभों के साथ।
वेज स्लाइस एक संशोधित मोटी टुकड़ा तैयारी है जो एमओसी न्यूरॉन्स में सर्किट एकीकरण की जांच के लिए डिज़ाइन की गई है (चित्रा 1 एमें स्कीमेट किया गया)। स्लाइस के मोटे पक्ष पर, कील में श्रवण तंत्रिका के कटे हुए एक्सॉन (इसके बाद “श्रवण तंत्रिका जड़” कहा जाता है) होता है क्योंकि वे सीएन में परिधि और सिनेप्स से ब्रेनस्टेम में प्रवेश करते हैं। श्रवण तंत्रिका जड़ को पूरी तरह से अक्षुण्ण सीएन 42 , 43 ,44,45 , 46की कोशिकाओं की न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज औरसिनैप्टिकसक्रियता पैदा करने के लिए विद्युत रूप से उत्तेजित किया जासकताहै। इस उत्तेजना प्रारूप सर्किट विश्लेषण के लिए कई लाभ है। सबसे पहले, एमओसी न्यूरॉन्स को अफ़ुरेंट इनपुट प्रदान करने वाले टी-स्टेलेट और जीबीसी एक्सॉन को सीधे उत्तेजित करने के बजाय, हम सीएन में प्रचुर मात्रा में आंतरिक सर्किट की सक्रियता की अनुमति देने के लिए एक को उत्तेजित करते हैं। ये सर्किट सीएन न्यूरॉन्स के आउटपुट को पूरे मस्तिष्क में अपने लक्ष्यों में मिलाते हैं, जिनमें एमओसी न्यूरॉन्स46,47 ,48,49,50, 51शामिल हैं। दूसरा, MOC न्यूरॉन्स के सीएन अपस्ट्रीम के माध्यम से एएन से एफेरेंट सर्किट की पॉलीसाइनैप्टिक सक्रियण अधिक प्राकृतिक सक्रियण समय के लिए और प्लास्टिसिटी के लिए इन सिनेप्स पर होने की अनुमति देता है क्योंकि वे श्रवण उत्तेजना के दौरान वीवो में होते हैं। तीसरा, हम एक गतिविधि की नकल करने के लिए हमारे उत्तेजना पैटर्न भिन्न हो सकते हैं। अंत में, MOC न्यूरॉन्स के लिए उत्तेजक और निरोधात्मक मोनारल दोनों अनुमानों कील टुकड़ा में बरकरार हैं, और उनके एकीकरण पैच-क्लैंप इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी की परिशुद्धता के साथ एक MOC न्यूरॉन पर मापा जा सकता है । एक पूरे के रूप में, यह सक्रियण योजना एक विशिष्ट मस्तिष्क स्लाइस तैयारी की तुलना में एमओसी न्यूरॉन्स को अधिक बरकरार सर्किट प्रदान करती है। इस ब्रेनस्टेम वेज स्लाइस का उपयोग अन्य श्रवण क्षेत्रों की जांच करने के लिए भी किया जा सकता है जो पार्श्व सुपीरियर जैतून, बेहतर ओलिवरी न्यूक्लियस और मध्यवर्ती बेहतर जैतून 10,11,52, 53 , 54,55, 56,56सहित इप्सिल्टरल एमएनएलबी से निरोधात्मक इनपुट प्राप्त करते हैं। हमारी विशिष्ट तैयारी से परे, लंबी दूरी के आदानों की कनेक्टिविटी बनाए रखने और विभिन्न प्रकार के एकल-सेल रिज़ॉल्यूशन इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी या इमेजिंग तकनीकों के लिए न्यूरॉन्स के दृश्य में सुधार के लाभों के साथ अन्य प्रणालियों का मूल्यांकन करने के लिए इस स्लाइसिंग विधि का उपयोग या संशोधित किया जा सकता है।
इस प्रोटोकॉल के लिए एक कंपन चरण या मंच के उपयोग की आवश्यकता होती है जिसे लगभग 15 डिग्री झुकाया जा सकता है। यहां हम एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध 2-टुकड़ा चुंबकीय चरण का उपयोग करते हैं जहां “चरण” एक धातु डिस्क है जिसमें एक घुमावदार नीचे एक अवतल चुंबकीय “चरण आधार” में रखा गया है। इसके बाद स्लाइस एंगल को एडजस्ट करने के लिए स्टेज को शिफ्ट किया जा सकता है । चरण आधार पर गाढ़ा हलकों का उपयोग कोण को पुन: पेश करने के लिए किया जाता है। स्टेज और स्टेज बेस को स्लाइसिंग चैंबर में रखा जाता है, जहां मैग्नेटिक स्टेज बेस को भी घुमाया जा सकता है ।
यहां वर्णित टुकड़ा करने की प्रक्रिया को बरकरार प्रेसिनैप्टिक न्यूरोनल सर्किटरी बनाए रखने के लिए शक्तिशाली है, लेकिन न्यूरोनल फ़ंक्शन के विश्लेषण के लिए मस्तिष्क टुकड़ा प्रयोग की पहुंच के साथ। सर्क?…
The authors have nothing to disclose.
इस शोध को एनआईएच, एनआईडीसीडी, जेड01 DC000091 (CJCW) के इंट्राम्यूरल रिसर्च प्रोग्राम ने सपोर्ट किया ।
Experimental Preparations | |||
Agar, powder | Fisher Scientific | BP1423500 | 4% agar block used to stabilize brain tissue during vibratome sectioning |
AlexaFluor Hydrazide 488 | Invitrogen | A10436 | Fluorophore used in internal solution to confirm successful MOC neuron patch |
Analytical Balance | Geneses Scientific (Intramalls) | AV114 | Weighing chemicals |
Double edged razor blade | Ted Pella | 121-6 | Vibratome cutting blade |
Kynurenic acid (5g) | Sigma Aldrich | K3375-5G | Slicing ACSF additive used to reduce neuron activity during dissection and slicing in order to improve tissue health for patch clamping |
pH Meter | Fisher Scientific (Intramalls) | 13-620-451 | Solution pH tester |
Plastic petri dishes 100mm dia X 20mm | Fisher Scientific (Intramalls) | 12-556-002 | 4% Agar Prep |
Stirring Hotplate | Fisher Scientific (Intramalls) | 11-500-150 | Heating for 4% Agar preparation |
Dissection and Slicing | |||
Biocytin | Sigma Aldrich | B4261-250MG | Chemical used for axonal tracing (conjugated to Streptavidin 488) |
Dissecting Microscope | Amscope | SM-1BN | For precision dissection during brain removal |
Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | Fine forceps dissection tool |
Economy tweezers #3 | WPI | 501976 | Forceps dissection tool |
Glass Petri Dish 150mm dia x 15mm H | Fisher Scientific (Intramalls) | 08-747E | Dissection dish |
Interface paper (203 X 254mm PCTE Membrane 10um) | Thomas Scientific | 1220823 | Slice incubation/biocytin application |
Leica VT1200S Vibratome | Leica | 1491200S001 | Vibratome for wedge slice sectioning |
Mayo scissors | Roboz | RS-6872 | Dissection tool |
Single-edged carbon steel blades | Fisher Scientific (Intramalls) | 12-640 | Razor blade for dissection |
Specimen disc, orienting | Leica | 14048142068 | Specialized vibratome stage for reproducible tilting |
Spoonula | FisherSci | 14-375-10 | Dissection tool |
Super Glue | Newegg | 15187 | Used for glueing tissue to vibratome stage |
Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | Dissection tool |
Electrophysiology | |||
A1R Upright Confocal Microscope | Nikon Instruments | Electrophysiology and imaging microscope, can be any microscope compatible with electrophysiology | |
Electrode Borosilicate glass w/ Filament OD 1.5mm, ID 1.1mm, 10 cm long | Sutter Instrument | BF150-110-10 | Patch clamping pipette glass |
Electrode Filler MicroFil | WPI | CMF20G | Patch electrode pipette filler |
In-line solution heater | Warner Instruments (GSAdvantage) | SH-27B | Slice perfusion system heater |
Multi-Micromanipulator Systems | Sutter Intruments | MPC-200 with MP285 | Micromanipulators for patch clamp and stimulation electrode placement |
P-1000 horizontal pipette puller for glass micropipettes | Sutter instruments | FG-P1000 | Patch clamp pipetter puller |
Patch-clamp amplifier and Software | HEKA | EPC-10 / Patchmaster Next | Can be any amplifier/software |
Recording Chamber | Warner Instruments | RC26G | Slice "bath" during recording |
Recording Chamber Harp | Warner Instruments | 640253 | Stablizes slice during electrophysiology recording |
Slice Incubation Chamber | Custom Build | Heated, oxygenated holding chamber for slices during recovery after slicing | |
Stimulus isolation unit | A.M.P.I. | Iso-Flex | Stimulus isolation unit for electrophysiology |
Syringe 60CC | Fischer Scientific (Intramalls) | 14-820-11 | Electrophysiology perfusion fluid handling |
Temperature controller | Warner Instruments (GSAdvantage) | TC-324C | Slice perfusion system temperature controller |
Tubing 1/8 OD 1/16 ID | Fischer Scientific (Intramalls) | 14-171-129 | Electrophysiology perfusion fluid handling |
Tugsten concentric bipolar microelectrode | WPI | TM33CCINS | Stimulating electrode for electrophysiology |
Histology | |||
24 well Plate | Fisher Scientific (Intramalls) | 12-556006 | Histology slice collection and immunostaining |
Alexa Fluor 488 Streptavidin | Jackson Immuno labs | 016-540-084 | Secondary antibody for biocytin visualization |
Corning Orbital Shaker | Sigma | CLS6780FP | Shaker for immunohistochemistry agitation |
Cresyl Violet Acetate | Sigma Aldrich (Intramalls) | C5042-10G | Cellular stain for histology |
Disposable Microtome Blades | Fisher Scientific | 22-210-052 | Sliding microtome blade |
Filter-syringe Nalgene 4mm Cellulose Acetate 0.2um | Fisher Scientific (Intramalls) | 09-740-34A | Syringe filter for filling recording pipettes with internal solution |
Fluoromount-G Slide Mounting Medium | Fisher Scientific | OB100-01 | Immunohistochemistry fluorescence mounting medium |
glass slide staining dish with rack | Fisher Scientific (Intramalls) | 08-812 | Cresyl Violet staining chamber |
Microm HM450 Sliding Microtome | ThermoFisher | 910020 | Freezing microtome for histology |
Microscope Cover Glasses: Rectangles 50mm X 24mm | Fisher Scientific (Intramalls) | 12-543D | Histochemistry slide cover glass |
Permount mounting medium | Fisher Scientific | SP15-100 | Cresyl violet section mounting medium |
Superfrost Slides | Fisher Scientific | 22-034980 | Histology slides |