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Neurosciences

生体内ニューロン回路接続を模倣するためのインビトロウェッジスライスの準備

Published: August 18, 2020
doi:
10.3791/61664
,
1Section on Neuronal Circuitry, National Institute on Deafness and Other Communication Disorders,NIH

Summary

ニューロンへの多様なシナプス入力の統合は、自然なタイミングと回路の可塑性のためにすべてのシナプス前核を保存する準備で最もよく測定されますが、脳スライスは通常、多くの接続を切断します。インビボ回路活性を模倣しながら、インビトロ実験能力を維持する修飾脳スライスを開発しました。

Abstract

インビトロスライスの電気生理学の技術は精密な電気および時間的決断の単細胞活動を測定する。脳スライスは、パッチクランプやイメージングのためにニューロンを適切に視覚化してアクセスするために比較的薄くする必要があり、脳回路のインビトロ検査は急性スライスに物理的に存在するものだけに限定されます。シナプス前核の大部分を維持しながらインビトロスライス実験の利点を維持するために、我々は新しいスライス調製物を開発した。この「ウェッジスライス」は、脳幹の内側オリボコクレア(MOC)ニューロンへの多様なモノラル、音駆動入力を特徴付けるために、パッチクランプ電気生理学の録音用に設計されました。これらのニューロンは、対側耳および対応する人工内核(CN)における刺激によって活性化されたニューロンから、その主要な刺激性および抑制性入力を受ける。非対称の脳スライスは、1つの半球の横端にあるロストロ・カウダル領域で最も厚く、反対側の半球の横端に向かって薄く設計されました。このスライスには、厚い側に、聴覚神経根が脳に聴覚刺激に関する情報を伝え、本質的なCN回路、および逆MOCニューロンに収束する不活性化および三シナプス阻害性の両方の経路が含まれている。記録は、スライスの薄い側のMOCニューロンから行われ、一般的なパッチクランプ実験のためにDIC光学を使用して視覚化されます。聴神経の直接刺激は、聴神経の脳幹に入る時に行われ、MOCニューロンのシナプス上流で本質的なCN回路活性およびシナプス可塑性が起こることを可能にする。この技術により、in vivo回路の活性化をスライス内で可能な限り近づけることができます。このウェッジスライス調製物は、インビトロスライス生理学の技術的利点と組み合わせて、回路分析が上流接続性と長距離入力の保存の恩恵を受ける他の脳回路に適用可能です。

Introduction

神経回路の活動の観察は、理想的には、生体内の脳領域間のネイティブ感覚入力とフィードバック、および無傷の接続性で行われます。しかし、神経回路の単一細胞分解能を与える実験を行うことは、無傷の脳における技術的な課題によって依然として制限されている。生体内の細胞外電気生理学または多光子イメージング法は、インタクト神経系の活動を調査するために使用できますが、異なる入力がどのように統合されるかの解釈や閾値以下のシナプス入力の測定は困難なままです。インビボ全細胞記録はこれらの制限を克服するが、容易にアクセスされる脳領域でさえ、実行することは困難である。単一細胞分解能実験の技術的課題は、脳の深部に位置する特定のニューロン集団、または生体内の細胞を見つけるために遺伝的ツールを必要とする空間的に拡散集団(例えば、オプトロード記録と組み合わせたチャネロドプシンの遺伝的発現)または標識を記録した後のポストホックの細胞化学的同定(例えば神経伝達特異的マーカーを有する)でさらに増幅される。脳幹の腹側表面の近くに拡散して位置している内側オリボコクリア(MOC)ニューロンは、上記の制限1に苦しんで、生体内実験のためにアクセスすることは非常に困難です。

脳のスライス(約100〜500μmの厚さ)は、同じスライス2、3、4、5、6、7、8、9に含まれる接続ニューロンの物理的な分離のために、聴覚脳幹回路を含む脳回路を研究するために長い間使用されてきました。より厚いスライス(>1 mm)を用いた実験は、内側優れたオリーブ10,11を含む優れたオリバリ複合体(SOC)の領域における二国間入力の統合方法を理解するために他の研究室で採用されている。これらのスライスは、聴覚神経(AN)の軸索がスライス内にそのまま残り、CNでシナプス神経伝達物質の放出を開始するために電気的に刺激されるように調製され、音に反応する第一次聴覚ニューロンの活性を模倣した。これらの厚いスライスの1つの大きな欠点は、パッチクランプ電気生理学的記録(「パッチング」)のためのニューロンの可視性です。この領域の多数の軸索が12歳、13歳、14歳、15歳でミリン化され、典型的で薄い脳スライスでも組織が光学的に密で隠れたニューロンを作り出すにつれて、パッチ適用はますます困難になります。私たちの目標は、インビボ録音の回路接続性に似ていますが、脳スライスの視覚的にガイドされたパッチクランプ電気生理学の高スループットと高解像度の記録能力を備えたインビトロ製剤を作成することです。

私たちの研究室では、MOCニューロンを含む聴覚系のニューロンの生理学を調査しています。これらのコリン作動性ニューロンは、外毛細胞(OHCs)16、17、18、19、20の活性を調節することによって、内毛にフィードバックを提供する。以前の研究では、この変調は、21、22、23、24、25、26および音響外傷から27、28、29、30、31、32、33からの保護における利得制御の役割を果たしていることを示している。マウスにおいて、MOCニューロンは、聴覚脳幹1の台形体(VNTB)の腹側核に拡散的に位置する。我々のグループは、TdTomatoレポーターマウスラインと交差するChAT-IRES-Creマウスラインを利用して、エピ蛍光照明下の脳幹スライス中のMOCニューロンを標的にしました。MOCニューロンは、立ち上がる台形体のイプシラテラ内側核(MNTB)から、逆側内頭核(CN)34、35、36、37、38の球状ふさふさ細胞(GBC)からの軸索によって、アッフェレント阻害性入力を受け取っていることを示した。さらに、MOCニューロンは、反側CN39、40、41のT-ステラート細胞から興奮性入力を受け取る可能性が高い。これらの研究は、MOCニューロンが同じ(対側)耳に由来する興奮性および阻害性入力の両方を受け取る。しかし、シナプス前ニューロンとMOCニューロンに収束する軸索は、典型的なコロナスライス調製物で完全に無傷であるほど互いに近くはない。MOCニューロンへのシナプス入力の統合が、新たに説明された阻害に焦点を当てて、その作用電位の発火パターンにどのような影響を与えるかを調べるため、可能な限り生理学的に現実的な方法で、インビトロ脳スライス実験の技術的利点を持つ、片耳からMOCニューロンに多様な異なるアファレントを刺激できる製剤を開発しました。

ウェッジスライスは、MOCニューロンの回路統合の調査のために設計された修正された厚いスライス調製物です(図1Aでスキーマ化)。スライスの厚い側には、末端の神経とシナプスから脳幹に入ると、内神経(以下「聴神経根」と呼ばれる)の切断された軸索が含まれています。聴覚神経根は、神経伝達物質放出を誘発し、完全に無傷のCN42、43、44、45、46の細胞のシナプス活性化を誘発するように電気的に刺激することができる。この刺激形式には、回路解析にはいくつかの利点があります。まず、MOCニューロンに対して発泡性の入力を提供するT-stellateおよびGBC軸索を直接刺激するのではなく、ANを刺激して、CNに豊富な固有回路の活性化を可能にします。これらの回路は、MOCニューロン46、47、48、49、50、51を含む脳全体の目標にCNニューロンの出力を調節する。第二に、ANからMOCニューロンのCN上流を通るアッフェラプス回路の多シナプス活性化は、聴覚刺激中に生体内で起こるように、より自然な活性化タイミングと可塑性がこれらのシナプスで起こることを可能にする。第三に、AN活動を模倣するために刺激パターンを変えることができます。最後に、MOCニューロンに対する興奮性および阻害的なモノラル投影は、ウェッジスライス内でそのままであり、その統合はパッチクランプ電気生理学の精度を有するMOCニューロンで測定することができる。全体として、この活性化スキームは、典型的な脳スライス調製物と比較してMOCニューロンに、より無傷の回路を提供する。この脳幹のくさびのスライスはまた、横方優れたオリーブ、優れたオリバリー核および内側優れたオリーブ10、11、52、53、54、55、56を含むイプシララルMNTBから阻害的な入力を受ける他の聴覚領域を調査するために使用することができる。当社の具体的な準備を超えて、このスライス法は、長距離入力の接続性を維持し、さまざまな単一細胞分解能電気生理学またはイメージング技術のためのニューロンの視覚化を改善するという利点を持つ他のシステムを評価するために使用または変更することができます。

このプロトコルは、約15°傾けることができるビブラートの段階またはプラットフォームの使用を必要とします。ここでは、市販の2ピース磁気ステージを使用し、「ステージ」は凹型磁気「ステージベース」に配置された湾曲した底を持つ金属ディスクです。ステージをシフトしてスライス角度を調整できます。ステージベースの同心円は、再現的に角度を推定するために使用されます。ステージとステージベースは、磁気ステージベースも回転させることができるスライスチャンバーに配置されます。

Protocol

すべての実験手順は、国立神経疾患研究所と脳卒中/国立難聴およびその他のコミュニケーション障害研究所動物のケアと使用委員会によって承認されました。 1. 実験準備 注:スライス液、スライス温度、スライスインキュベーション温度、装置(など)を含むスライス調製物に関する詳細は、本実験で行う脳幹製剤に特有のものです。スライスインキュ?…

Representative Results

ウェッジスライスの組織学的検査聴覚脳幹ニューロン機能の調査のために、ウェッジスライス製剤は、記録対象のMOCニューロンに対する聴覚神経根およびCN反局面を含むように設計された(図1Bに示すスライスの例)。最初の組織学的検査は、スライスが回路活性化に必要な核を含み、軸索突起がそのままであることを確認するために重要である。CN内の2つ?…

Discussion

ここで説明するスライス手順は、ウェッジスライスと呼ばれ、無傷のシナプス前神経回路を維持するために強力であるが、神経機能の分析のための脳スライス実験のアクセシビリティを有する。回路解析の準備の有用性を最大限に高めるためには、いくつかの初期ステップで細心の注意を払う必要があります。ウェッジの寸法は、シナプス前核とその軸索突起の両方が準備されたウェッジス?…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、NIHの壁内研究プログラム、NIDCD、Z01 DC00091(CJCW)によって支援されました。

Materials

Experimental Preparations
Agar, powder Fisher Scientific BP1423500 4% agar block used to stabilize brain tissue during vibratome sectioning
AlexaFluor Hydrazide 488 Invitrogen A10436 Fluorophore used in internal solution to confirm successful MOC neuron patch
Analytical Balance Geneses Scientific (Intramalls) AV114 Weighing chemicals
Double edged razor blade Ted Pella 121-6 Vibratome cutting blade
Kynurenic acid (5g) Sigma Aldrich K3375-5G Slicing ACSF additive used to reduce neuron activity during dissection and slicing in order to improve tissue health for patch clamping
pH Meter Fisher Scientific (Intramalls) 13-620-451 Solution pH tester
Plastic petri dishes 100mm dia X 20mm Fisher Scientific (Intramalls) 12-556-002 4% Agar Prep
Stirring Hotplate Fisher Scientific (Intramalls) 11-500-150 Heating for 4% Agar preparation
Dissection and Slicing
Biocytin Sigma Aldrich B4261-250MG Chemical used for axonal tracing (conjugated to Streptavidin 488)
Dissecting Microscope Amscope SM-1BN For precision dissection during brain removal
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11252-20 Fine forceps dissection tool
Economy tweezers #3 WPI 501976 Forceps dissection tool
Glass Petri Dish 150mm dia x 15mm H Fisher Scientific (Intramalls) 08-747E Dissection dish
Interface paper (203 X 254mm PCTE Membrane 10um) Thomas Scientific 1220823 Slice incubation/biocytin application
Leica VT1200S Vibratome Leica 1491200S001 Vibratome for wedge slice sectioning
Mayo scissors Roboz RS-6872 Dissection tool
Single-edged carbon steel blades Fisher Scientific (Intramalls) 12-640 Razor blade for dissection
Specimen disc, orienting Leica 14048142068 Specialized vibratome stage for reproducible tilting
Spoonula FisherSci 14-375-10 Dissection tool
Super Glue Newegg 15187 Used for glueing tissue to vibratome stage
Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 91500-09 Dissection tool
Electrophysiology
A1R Upright Confocal Microscope Nikon Instruments Electrophysiology and imaging microscope, can be any microscope compatible with electrophysiology
Electrode Borosilicate glass w/ Filament OD 1.5mm, ID 1.1mm, 10 cm long Sutter Instrument BF150-110-10 Patch clamping pipette glass
Electrode Filler MicroFil WPI CMF20G Patch electrode pipette filler
In-line solution heater Warner Instruments (GSAdvantage) SH-27B Slice perfusion system heater
Multi-Micromanipulator Systems Sutter Intruments MPC-200 with MP285 Micromanipulators for patch clamp and stimulation electrode placement
P-1000 horizontal pipette puller for glass micropipettes Sutter instruments FG-P1000 Patch clamp pipetter puller
Patch-clamp amplifier and Software HEKA EPC-10 / Patchmaster Next Can be any amplifier/software
Recording Chamber Warner Instruments RC26G Slice "bath" during recording
Recording Chamber Harp Warner Instruments 640253 Stablizes slice during electrophysiology recording
Slice Incubation Chamber Custom Build Heated, oxygenated holding chamber for slices during recovery after slicing
Stimulus isolation unit A.M.P.I. Iso-Flex Stimulus isolation unit for electrophysiology
Syringe 60CC Fischer Scientific (Intramalls) 14-820-11 Electrophysiology perfusion fluid handling
Temperature controller Warner Instruments (GSAdvantage) TC-324C Slice perfusion system temperature controller
Tubing 1/8 OD 1/16 ID Fischer Scientific (Intramalls) 14-171-129 Electrophysiology perfusion fluid handling
Tugsten concentric bipolar microelectrode WPI TM33CCINS Stimulating electrode for electrophysiology
Histology
24 well Plate Fisher Scientific (Intramalls) 12-556006 Histology slice collection and immunostaining
Alexa Fluor 488 Streptavidin Jackson Immuno labs 016-540-084 Secondary antibody for biocytin visualization
Corning Orbital Shaker Sigma CLS6780FP Shaker for immunohistochemistry agitation
Cresyl Violet Acetate Sigma Aldrich (Intramalls) C5042-10G Cellular stain for histology
Disposable Microtome Blades Fisher Scientific 22-210-052 Sliding microtome blade
Filter-syringe Nalgene 4mm Cellulose Acetate 0.2um Fisher Scientific (Intramalls) 09-740-34A Syringe filter for filling recording pipettes with internal solution
Fluoromount-G Slide Mounting Medium Fisher Scientific OB100-01 Immunohistochemistry fluorescence mounting medium
glass slide staining dish with rack Fisher Scientific (Intramalls) 08-812 Cresyl Violet staining chamber
Microm HM450 Sliding Microtome ThermoFisher 910020 Freezing microtome for histology
Microscope Cover Glasses: Rectangles 50mm X 24mm Fisher Scientific (Intramalls) 12-543D Histochemistry slide cover glass
Permount mounting medium Fisher Scientific SP15-100 Cresyl violet section mounting medium
Superfrost Slides Fisher Scientific 22-034980 Histology slides
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Citer Cet Article
Fischl, M. J., Weisz, C. J. C. In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity. J. Vis. Exp. (162), e61664, doi:10.3791/61664 (2020).
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