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Neurosciences

In Vitro Wedge Slice Preparación para imitar la conectividad del circuito neuronal In Vivo

Published: August 18, 2020
doi:
10.3791/61664
,
1Section on Neuronal Circuitry, National Institute on Deafness and Other Communication Disorders,NIH

Summary

La integración de diversas entradas sinápticas a las neuronas se mide mejor en una preparación que preserva todos los núcleos presinápticos para la sincronización natural y la plasticidad del circuito, pero las rebanadas cerebrales suelen cortar muchas conexiones. Desarrollamos una rebanada cerebral modificada para imitar la actividad del circuito in vivo mientras mantenemos la capacidad de experimentación in vitro.

Abstract

Las técnicas de electrofisiología de rebanadas in vitro miden la actividad de una sola célula con una resolución eléctrica y temporal precisa. Las rebanadas cerebrales deben ser relativamente delgadas para visualizar y acceder adecuadamente a las neuronas para la sujeción de parches o imágenes, y el examen in vitro de los circuitos cerebrales se limita sólo a lo que está físicamente presente en la rebanada aguda. Para mantener los beneficios de la experimentación in vitro en rodajas conservando al mismo tiempo una porción más grande de núcleos presinápticos, desarrollamos una nueva preparación de la rebanada. Esta “rebanada de cuña” fue diseñada para grabaciones electrofisiología de parches-pinza para caracterizar las diversas entradas monoaurales impulsadas por sonido a las neuronas olivocochlear medial (MOC) en el tronco cerebral. Estas neuronas reciben sus entradas excitatorias e inhibitorias aferentes primarias de las neuronas activadas por estímulos en el oído contralateral y el núcleo coclear correspondiente (CN). Se diseñó una rebanada cerebral asimétrica que es más gruesa en el dominio rostro-caudal en el borde lateral de un hemisferio y luego se adelgaza hacia el borde lateral del hemisferio opuesto. Esta rebanada contiene, en el lado grueso, la raíz nerviosa auditiva que transmite información sobre los estímulos auditivos al cerebro, el circuito NC intrínseco, y tanto el excitatorio disynaptic y trisináptica inhibitorio aferente vías que convergen en las neuronas MOC contralaterales. La grabación se realiza a partir de neuronas MOC en el lado delgado de la rebanada, donde se visualizan utilizando óptica DIC para experimentos típicos de abrazadera de parche. La estimulación directa del nervio auditivo se realiza al entrar en el tronco cerebral auditivo, lo que permite que la actividad intrínseca del circuito CN y la plasticidad sináptica se produzcan en las sinapsis aguas arriba de las neuronas MOC. Con esta técnica, se puede imitar la activación del circuito in vivo lo más cerca posible dentro de la rebanada. Esta preparación de la rebanada de cuña es aplicable a otros circuitos cerebrales donde los análisis de circuitos se beneficiarían de la preservación de la conectividad aguas arriba y las entradas de largo alcance, en combinación con las ventajas técnicas de la fisiología in vitro de las rebanadas.

Introduction

La observación de la actividad de los circuitos neuronales se realiza idealmente con entradas sensoriales nativas y retroalimentación, y conectividad intacta entre las regiones cerebrales, in vivo. Sin embargo, la realización de experimentos que dan resolución de una sola célula de la función del circuito neural todavía está limitada por desafíos técnicos en el cerebro intacto. Mientras que la electrofisiología extracelular in vivo o los métodos de imagen multifoton se pueden utilizar para investigar la actividad en sistemas nerviosos intactos, interpretar cómo diferentes entradas integran o miden las entradas sinápticas de subtrasinas sigue siendo difícil. Las grabaciones de células enteras in vivo superan estas limitaciones, pero son difíciles de realizar, incluso en regiones cerebrales a las que se puede acceder fácilmente. Los desafíos técnicos de los experimentos de resolución de una sola célula se amplifican aún más en ciertas poblaciones de neuronas que se encuentran en lo profundo del cerebro, o en poblaciones espacialmente difusas que requieren herramientas genéticas para localizar células in vivo (por ejemplo, expresión genética de channelrhodopsin emparejada con registro de optrode) o identificación histoquímica post-hoc después de registrar el etiquetado del sitio (por ejemplo, con marcadores específicos de la neurotransmisión). Al estar ubicadas difusamente cerca de la superficie ventral del tronco cerebral, las neuronas olivocochlear medial (MOC) sufren de las limitaciones anteriores1,por lo que son extremadamente difíciles de acceder para la experimentación in vivo.

Las rebanadas cerebrales (espesor de 100-500 m) se han utilizado durante mucho tiempo para estudiar los circuitos cerebrales, incluyendo circuitos auditivos de tronco encefálica, debido a la segregación física de las neuronas conectadas que se encuentran dentro de la misma rebanada2,3,4,5,6,7,8,9. En otros laboratorios se han empleado experimentos con rodajas mucho más gruesas (>1 mm) para entender cómo se integran las entradas bilaterales en áreas del complejo olivar superior (SOC), incluyendo la aceituna superior medial10,11. Estas rebanadas se prepararon de tal manera que los axones del nervio auditivo (AN) permanecieron intactos dentro de la rebanada y fueron estimulados eléctricamente para iniciar la liberación de neurotransmisores sinápticos en el CN, imitando la actividad de las neuronas auditivas de primer orden, ya que responderían al sonido. Una de las principales desventajas de estas rebanadas gruesas es la visibilidad de las neuronas para las grabaciones electrofisiológicas de la abrazadera de parches (“parcheing”). Parchear se vuelve cada vez más difícil a medida que los numerosos axones de esta zona se miinantican conedades de 12,13,14,15años, haciendo que el tejido ópticamente denso y oscureciendo las neuronas incluso en una rebanada cerebral típica, delgada. Nuestro objetivo es crear preparaciones in vitro que se asemejen más a la conectividad de circuito de las grabaciones in vivo, pero con las capacidades de grabación de alto rendimiento y alta resolución de la electrofisiología de la abrazadera de parche guiada visualmente en las rebanadas cerebrales.

Nuestro laboratorio investiga la fisiología de las neuronas del sistema auditivo eferente, incluidas las neuronas MOC. Estas neuronas colinérgicas proporcionan una retroalimentación eferente a la cóclea modulando la actividad de las células pilosas externas (OHC)16,17,18,19,20. Estudios previos han demostrado que esta modulación juega un papel en el control de ganancia en la cóclea21,22,23,24,25,26 y la protección contra el trauma acústico27,28,29,30,31,32,33. En ratones, las neuronas MOC se encuentran difusamente en el núcleo ventral del cuerpo trapezoidal (VNTB) en el tronco cerebral auditivo1. Nuestro grupo ha utilizado la línea de ratón ChAT-IRES-Cre cruzada con la línea de ratón reportero tdTomato para apuntar a las neuronas MOC en rebanadas de tronco cerebral bajo iluminación epifluorescente. Mostramos que las neuronas MOC reciben una aporte inhibitoria aferente del núcleo medial ipsilateral del cuerpo trapezoide (MNTB), que está excitado, a su vez, por axones de células tupidas globulares (GBC) en el núcleo coclear contralateral (CN)34,35,36,37,38. Además, las neuronas MOC probablemente reciben su entrada excitatoria de células T-estelares en el NC contralateral39,40,41. En conjunto, estos estudios muestran que las neuronas MOC reciben insumos excitatorios e inhibitorios derivados del mismo oído (contralateral). Sin embargo, las neuronas presinápticas, y sus axones convergentes en las neuronas MOC, no están lo suficientemente cerca unas de otras para estar completamente intactas en una preparación típica de la rebanada coronal. Para investigar cómo la integración de las entradas sinápticas a las neuronas MOC afecta a sus patrones de disparo potencial de acción, con un enfoque en la inhibición recién descrita, desarrollamos una preparación en la que podríamos estimular los diversos aferentes a las neuronas MOC de un oído de la manera más realista fisiológicamente posible, pero con los beneficios técnicos de los experimentos in vitro de la división cerebral.

La rebanada de cuña es una preparación de rodaja gruesa modificada diseñada para la investigación de la integración de circuitos en neuronas MOC (esquemática en la Figura 1A). En el lado grueso de la rebanada, la cuña contiene los axones cortados del nervio auditivo (llamado “raíz nerviosa auditiva” en lo sucesivo) a medida que entran en el tronco encefálica desde la periferia y la sinapsis en el NC. La raíz nerviosa auditiva se puede estimular eléctricamente para evocar la liberación de neurotransmisores y la activación sináptica de las células de la CN42completamenteintacta,43,44,45,46. Este formato de estimulación tiene varios beneficios para el análisis de circuitos. En primer lugar, en lugar de estimular directamente los axones T-estelar y GBC que proporcionan una entrada diferente a las neuronas MOC, estimulamos la AN para permitir la activación de circuitos intrínsecos abundantes en la NC. Estos circuitos modulan la salida de las neuronas CN a sus objetivos en todo el cerebro, incluyendo las neuronas MOC46,47,48,49,50,51. En segundo lugar, la activación polisináptica de los circuitos aferentes desde el AN a través de la CN aguas arriba de las neuronas MOC permite un tiempo de activación más natural y que la plasticidad se produzca en estas sinapsis como lo harían in vivo durante la estimulación auditiva. En tercer lugar, podemos variar nuestros patrones de estimulación para imitar la actividad ano. Por último, las proyecciones monoaurales excitatorias e inhibitorias a las neuronas MOC están intactas en la rodaja de cuña, y su integración se puede medir en una neurona MOC con la precisión de la electrofisiología de la abrazadera de parche. En su conjunto, este esquema de activación proporciona un circuito más intacto a las neuronas MOC en comparación con una preparación típica de la rebanada cerebral. Esta rebanada de cuña de tronco encefálica también se puede utilizar para investigar otras áreas auditivas que reciben aporte inhibitorio de MNTB ipsilateral incluyendo la aceituna superior lateral, núcleo olivario superior y aceituna medial superior10,11,52,53,54,55,56. Más allá de nuestra preparación específica, este método de corte se puede utilizar o modificar para evaluar otros sistemas con los beneficios de mantener la conectividad de entradas de largo alcance y mejorar la visualización de las neuronas para una variedad de electrofisiología de resolución de una sola célula o técnicas de imagen.

Este protocolo requiere el uso de una etapa vibratoria o una plataforma que se puede inclinar aproximadamente 15o. Aquí utilizamos una etapa magnética de 2 piezas disponible comercialmente donde la “etapa” es un disco de metal con un fondo curvo colocado en una “base de etapa” magnética cóncava. A continuación, se puede desplazar el escenario para ajustar el ángulo de corte. Los círculos concéntricos en la base del escenario se utilizan para estimar el ángulo de forma reproducible. La base de la etapa y la etapa se colocan en la cámara de corte, donde también se puede girar la base de la etapa magnética.

Protocol

Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados por el Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares/Instituto Nacional sobre Sordera y Otros Trastornos de la Comunicación Comité de Cuidado y Uso Animal. 1. Preparaciones experimentales NOTA: Los detalles relativos a la preparación de la rebanada, incluyendo la solución de corte, la temperatura de corte, la temperatura de incubación de rodajas y el aparato (etc.) son espec?…

Representative Results

Examen histológico de la rodaja de cuñaPara nuestra investigación de la función de la neurona del tronco encefálica auditiva, la preparación de la rebanada de cuña fue diseñada para contener la raíz nerviosa auditiva y la NC contralateral a las neuronas MOC dirigidas a las grabaciones (ejemplo de sector mostrado en la Figura 1B). El examen histológico inicial de la preparación es importante para confirmar que la rebanada contiene los núcleos necesarios para l…

Discussion

El procedimiento de corte descrito aquí llamado una rebanada de cuña es potente para mantener intacta el circuito neuronal presináptico, pero con la accesibilidad de la experimentación de la rebanada cerebral para el análisis de la función neuronal. Se debe tener mucho cuidado en varios pasos iniciales con el fin de maximizar la utilidad de la preparación para el análisis de circuitos. Las dimensiones de la cuña deben confirmarse mediante el examen histológico, que es fundamental para la confirmación de que ta…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Esta investigación fue apoyada por el Programa de Investigación Intramuros del NIH, NIDCD, Z01 DC000091 (CJCW).

Materials

Experimental Preparations
Agar, powder Fisher Scientific BP1423500 4% agar block used to stabilize brain tissue during vibratome sectioning
AlexaFluor Hydrazide 488 Invitrogen A10436 Fluorophore used in internal solution to confirm successful MOC neuron patch
Analytical Balance Geneses Scientific (Intramalls) AV114 Weighing chemicals
Double edged razor blade Ted Pella 121-6 Vibratome cutting blade
Kynurenic acid (5g) Sigma Aldrich K3375-5G Slicing ACSF additive used to reduce neuron activity during dissection and slicing in order to improve tissue health for patch clamping
pH Meter Fisher Scientific (Intramalls) 13-620-451 Solution pH tester
Plastic petri dishes 100mm dia X 20mm Fisher Scientific (Intramalls) 12-556-002 4% Agar Prep
Stirring Hotplate Fisher Scientific (Intramalls) 11-500-150 Heating for 4% Agar preparation
Dissection and Slicing
Biocytin Sigma Aldrich B4261-250MG Chemical used for axonal tracing (conjugated to Streptavidin 488)
Dissecting Microscope Amscope SM-1BN For precision dissection during brain removal
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11252-20 Fine forceps dissection tool
Economy tweezers #3 WPI 501976 Forceps dissection tool
Glass Petri Dish 150mm dia x 15mm H Fisher Scientific (Intramalls) 08-747E Dissection dish
Interface paper (203 X 254mm PCTE Membrane 10um) Thomas Scientific 1220823 Slice incubation/biocytin application
Leica VT1200S Vibratome Leica 1491200S001 Vibratome for wedge slice sectioning
Mayo scissors Roboz RS-6872 Dissection tool
Single-edged carbon steel blades Fisher Scientific (Intramalls) 12-640 Razor blade for dissection
Specimen disc, orienting Leica 14048142068 Specialized vibratome stage for reproducible tilting
Spoonula FisherSci 14-375-10 Dissection tool
Super Glue Newegg 15187 Used for glueing tissue to vibratome stage
Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 91500-09 Dissection tool
Electrophysiology
A1R Upright Confocal Microscope Nikon Instruments Electrophysiology and imaging microscope, can be any microscope compatible with electrophysiology
Electrode Borosilicate glass w/ Filament OD 1.5mm, ID 1.1mm, 10 cm long Sutter Instrument BF150-110-10 Patch clamping pipette glass
Electrode Filler MicroFil WPI CMF20G Patch electrode pipette filler
In-line solution heater Warner Instruments (GSAdvantage) SH-27B Slice perfusion system heater
Multi-Micromanipulator Systems Sutter Intruments MPC-200 with MP285 Micromanipulators for patch clamp and stimulation electrode placement
P-1000 horizontal pipette puller for glass micropipettes Sutter instruments FG-P1000 Patch clamp pipetter puller
Patch-clamp amplifier and Software HEKA EPC-10 / Patchmaster Next Can be any amplifier/software
Recording Chamber Warner Instruments RC26G Slice "bath" during recording
Recording Chamber Harp Warner Instruments 640253 Stablizes slice during electrophysiology recording
Slice Incubation Chamber Custom Build Heated, oxygenated holding chamber for slices during recovery after slicing
Stimulus isolation unit A.M.P.I. Iso-Flex Stimulus isolation unit for electrophysiology
Syringe 60CC Fischer Scientific (Intramalls) 14-820-11 Electrophysiology perfusion fluid handling
Temperature controller Warner Instruments (GSAdvantage) TC-324C Slice perfusion system temperature controller
Tubing 1/8 OD 1/16 ID Fischer Scientific (Intramalls) 14-171-129 Electrophysiology perfusion fluid handling
Tugsten concentric bipolar microelectrode WPI TM33CCINS Stimulating electrode for electrophysiology
Histology
24 well Plate Fisher Scientific (Intramalls) 12-556006 Histology slice collection and immunostaining
Alexa Fluor 488 Streptavidin Jackson Immuno labs 016-540-084 Secondary antibody for biocytin visualization
Corning Orbital Shaker Sigma CLS6780FP Shaker for immunohistochemistry agitation
Cresyl Violet Acetate Sigma Aldrich (Intramalls) C5042-10G Cellular stain for histology
Disposable Microtome Blades Fisher Scientific 22-210-052 Sliding microtome blade
Filter-syringe Nalgene 4mm Cellulose Acetate 0.2um Fisher Scientific (Intramalls) 09-740-34A Syringe filter for filling recording pipettes with internal solution
Fluoromount-G Slide Mounting Medium Fisher Scientific OB100-01 Immunohistochemistry fluorescence mounting medium
glass slide staining dish with rack Fisher Scientific (Intramalls) 08-812 Cresyl Violet staining chamber
Microm HM450 Sliding Microtome ThermoFisher 910020 Freezing microtome for histology
Microscope Cover Glasses: Rectangles 50mm X 24mm Fisher Scientific (Intramalls) 12-543D Histochemistry slide cover glass
Permount mounting medium Fisher Scientific SP15-100 Cresyl violet section mounting medium
Superfrost Slides Fisher Scientific 22-034980 Histology slides
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Citer Cet Article
Fischl, M. J., Weisz, C. J. C. In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity. J. Vis. Exp. (162), e61664, doi:10.3791/61664 (2020).
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