In Vitro Wedge Slice Voorbereiding voor het nabootsen van in Vivo Neuronal Circuit Connectiviteit

Summary

Integratie van diverse synaptische ingangen naar neuronen wordt het best gemeten in een preparaat dat alle pre-synaptische kernen voor natuurlijke timing en circuit plasticiteit behoudt, maar hersenen plakjes meestal verbreken veel verbindingen. We ontwikkelden een gemodificeerde hersenen slice na te bootsen in vivo circuit activiteit met behoud van in vitro experimentatie vermogen.

Abstract

In vitro slice elektrofysiologie technieken meten eencellige activiteit met nauwkeurige elektrische en temporele resolutie. Hersenen plakjes moeten relatief dun zijn om goed te visualiseren en toegang neuronen voor patch-clamping of imaging, en in vitro onderzoek van de hersenen circuits is beperkt tot alleen wat fysiek aanwezig is in de acute slice. Om de voordelen van in vitro slice experimenten te behouden met behoud van een groter deel van de presynaptische kernen, ontwikkelden we een nieuwe slice voorbereiding. Deze “wedge slice” is ontworpen voor patch-clamp elektrofysiologie opnames om de diverse monaurale, geluid-gedreven ingangen te middenn olivocochleaire (MOC) neuronen in de hersenstam te karakteriseren. Deze neuronen ontvangen hun primaire afferent excitatory en remmende ingangen van neuronen geactiveerd door stimuli in het contralaterale oor en overeenkomstige cochleaire kern (CN). Een asymmetrische hersenen slice werd ontworpen die het dikst is in de rostro-caudal domein aan de zijdelingse rand van een halfrond en vervolgens dunt naar de laterale rand van het andere halfrond. Dit segment bevat, aan de dikke kant, de auditieve zenuwwortel die informatie over auditieve stimuli naar de hersenen brengt, de intrinsieke CN-circuits, en zowel de disynaptische excitatory als trisynaptische remmende afferentepaden die samenkomen op contralaterale MOC-neuronen. Opname wordt uitgevoerd van MOC neuronen aan de dunne kant van het segment, waar ze worden gevisualiseerd met behulp van DIC optica voor typische patch-clamp experimenten. Directe stimulatie van de gehoorzenuw wordt uitgevoerd als het in de auditieve hersenstam, waardoor voor intrinsieke CN circuit activiteit en synaptische plasticiteit optreden bij synapsen stroomopwaarts van MOC neuronen. Met deze techniek kan men in vivo circuitactivering zo dicht mogelijk binnen het segment nabootsen. Deze wig slice voorbereiding is van toepassing op andere hersencircuits waar circuit analyses zouden profiteren van het behoud van upstream connectiviteit en lange afstand ingangen, in combinatie met de technische voordelen van in vitro slice fysiologie.

Introduction

Observatie van de activiteit van neurale circuits wordt idealiter uitgevoerd met native zintuiglijke ingangen en feedback, en intacte connectiviteit tussen hersengebieden, in vivo. Echter, het uitvoeren van experimenten die eencellige resolutie van neurale circuit functie te geven is nog steeds beperkt door technische uitdagingen in de intacte hersenen. Terwijl in vivo extracellulaire elektrofysiologie of multifoton beeldvormingsmethoden kunnen worden gebruikt voor het onderzoeken van activiteit in intacte zenuwstelsels, blijft het moeilijk om te interpreteren hoe verschillende ingangen integreren of subthreshold synaptische ingangen meten. In vivo hele cel opnames overwinnen deze beperkingen, maar zijn uitdagend uit te voeren, zelfs in hersengebieden die gemakkelijk toegankelijk zijn. Technische uitdagingen van eencellige resolutie experimenten worden verder versterkt in bepaalde neuron populaties die zich diep in de hersenen, of in ruimtelijk diffuse populaties die ofwel genetische instrumenten nodig om cellen te lokaliseren in vivo (bijvoorbeeld genetische expressie van channelrhodopsine in combinatie met optrode opname) of post-hoc histochemische identificatie na opname site etikettering (bijvoorbeeld met neurotransmissie-specifieke markers). Wordt diffuus gelegen in de buurt van het ventrale oppervlak van de hersenstam, mediale olivocochlear (MOC) neuronen lijden aan de bovenstaande beperkingen¹, waardoor ze zeer moeilijk te bereiken voor in vivo experimenten.

Hersensegmenten (~100-500 μm dikte) zijn al lang gebruikt om hersencircuits te bestuderen, inclusief auditieve hersenstamcircuits, vanwege de fysieke segregatie van verbonden neuronen die zich in hetzelfde segment^{2,3,4,5,6,7,8,9}bevinden. Experimenten met veel dikkere plakjes (>1 mm) zijn in andere laboratoria gebruikt om te begrijpen hoe bilaterale ingangen integreren in gebieden van het superieure olivarycomplex (SOC), waaronder de mediale superieure olijf^10,11. Deze plakjes werden zodanig bereid dat axonen van de gehoorzenuw (AN) intact bleven in de slice en werden elektrisch gestimuleerd om synaptische neurotransmitter release in de CN te starten, het nabootsen van activiteit van de eerste orde auditieve neuronen als ze zouden reageren op geluid. Een groot nadeel van deze dikke plakjes is de zichtbaarheid van neuronen voor patch-clamp elektrofysiologische opnames (“patching”). Patchen wordt steeds moeilijker als de vele axonen in dit gebied worden myelinated met de leeftijd^{van 12,13,14,15}, waardoor het weefsel optisch dicht en verduisterend neuronen, zelfs in een typische, dunne hersenen slice. Ons doel is om in vitro preparaten te creëren die meer lijken op de circuitconnectiviteit van in vivo opnames, maar met de hoge doorvoer en hoge-resolutie opnamemogelijkheden van visueel geleide patch-clamp elektrofysiologie in hersensegmenten.

Ons lab onderzoekt de fysiologie van neuronen van het auditieve efferentsysteem, waaronder MOC-neuronen. Deze cholinerge neuronen geven efferent feedback aan het slakkenplaat door de activiteit van buitenste haarcellen (OHC’s)¹⁶,^17,18,19,20te moduleren . Eerdere studies hebben aangetoond dat deze modulatie een rol speelt bij het verkrijgen van controle in het slakkenmiddel^{21,22,23,24,25,26} en bescherming tegen akoestisch trauma^{27,28,29,30,31,32,33}. Bij muizen bevinden MOC-neuronen zich diffuus in de ventrale kern van het trapeziumlichaam (VNTB) in de auditieve hersenstam¹. Onze groep heeft gebruik gemaakt van de ChAT-IRES-Cre muislijn gekruist met de tdTomato reporter muislijn te richten MOC neuronen in hersenstam plakjes onder epifluorescente verlichting. We toonden aan dat MOC-neuronen afferente-remmende input ontvangen van de ipsilaterale mediale kern van het trapeziumlichaam (MNTB), dat op zijn beurt wordt opgewekt door axonen van bolvormige bossige cellen (GBC) in de contralaterale cochleaire kern (CN)^{34,35,36,37,38}. Bovendien ontvangen MOC-neuronen waarschijnlijk hun excitatory input van T-stellate cellen in de contralaterale GN^39,40,41. Samen tonen deze studies aan dat MOC-neuronen zowel excitatory als remmende ingangen ontvangen die zijn afgeleid van hetzelfde (contralaterale) oor. Echter, de presynaptische neuronen, en hun axonen convergerende op MOC neuronen, zijn niet helemaal dicht genoeg bij elkaar om volledig intact in een typische coronale slice voorbereiding. Om te onderzoeken hoe de integratie van synaptische ingangen naar MOC-neuronen hun actiepotentieel beïnvloedt, met een focus op nieuw beschreven remming, ontwikkelden we een preparaat waarin we de diverse afferents naar MOC-neuronen vanuit één oor konden stimuleren op de meest fysiologisch realistische manier mogelijk, maar met de technische voordelen van in vitro brain slice-experimenten.

De wig slice is een gemodificeerde dikke slice voorbereiding ontworpen voor onderzoek van circuit integratie in MOC neuronen (schematized in figuur 1A). Aan de dikke kant van de plak, de wig bevat de afgehakte axonen van de gehoorzenuw (hierna “auditieve zenuwwortel” genoemd) als ze de hersenstam van de periferie en synaps in de CN binnendijzen. De gehoorzenuwwortel kan elektrisch worden gestimuleerd om neurotransmitter-release en synaptische activering van cellen van de volledig intacte GN^{42,43,44,45,46}op te roepen . Dit stimulatieformaat heeft verschillende voordelen voor circuitanalyse. Ten eerste, in plaats van het direct stimuleren van de T-stellate en GBC axonen die afferent input te leveren aan de MOC neuronen, stimuleren we de AN om activering van intrinsieke circuits overvloedig in de CN mogelijk te maken. Deze circuits moduleren de output van CN-neuronen naar hun doelen in de hersenen, waaronder MOC-neuronen^{46,47,48,49,50,51}. Ten tweede, de polysynaptische activering van afferent circuits van de AN via de CN stroomopwaarts van MOC neuronen zorgt voor meer natuurlijke activering timing en voor plasticiteit optreden bij deze synapsen als ze in vivo zou tijdens auditieve stimulatie. Ten derde kunnen we onze stimulatiepatronen variëren om EEN activiteit na te bootsen. Ten slotte zijn zowel excitatory als remmende monaurale projecties voor MOC-neuronen intact in de wigschijf, en hun integratie kan worden gemeten in een MOC-neuron met de precisie van patch-clamp elektrofysiologie. Als geheel, dit activeringsschema biedt een meer intact circuit aan de MOC neuronen in vergelijking met een typische hersenen slice voorbereiding. Deze hersenstam wig slice kan ook worden gebruikt om andere auditieve gebieden die remmende input ontvangen van ipsilaterale MNTB met inbegrip van de laterale superieure olijf, superieure olivary kern en mediale superieure olijf^{10,11,52,53,54,55,56}te onderzoeken . Naast onze specifieke voorbereiding kan deze snijmethode worden gebruikt of aangepast om andere systemen te evalueren met de voordelen van het behoud van connectiviteit van lange-afstandsingangen en het verbeteren van de visualisatie van neuronen voor een verscheidenheid aan eencellige resolutie elektrofysiologie of beeldvormingstechnieken.

Dit protocol vereist het gebruik van een vibratome stage of platform dat ongeveer 15° kan worden gekanteld. Hier gebruiken we een commercieel beschikbare 2-delige magnetische fase waar de “fase” is een metalen schijf met een gebogen bodem geplaatst in een holle magnetische “stage base.” Het stadium kan vervolgens worden verschoven om de segmenthoek aan te passen. Concentrische cirkels op de podiumbasis worden gebruikt om de hoek reproduceerbaar te schatten. Het podium en de trapbasis worden in de snijkamer geplaatst, waar ook de magnetische trapbasis kan worden gedraaid.

Protocol

Alle experimentele procedures werden goedgekeurd door het National Institute of Neurological Disorders and Stroke / National Institute on Doofness and Other Communication Disorders Animal Care and Use Committee. 1. Experimentele preparaten OPMERKING: Details met betrekking tot de bereiding van de slice, waaronder snijoplossing, snijtemperatuur, segment incubatietemperatuur en apparatuur (enz.) zijn specifiek voor de voorbereiding van de hersenstam die in dit experimen…

Representative Results

Histologisch onderzoek van wigschijfVoor ons onderzoek van auditieve hersenstam neuron functie, de wig slice voorbereiding is ontworpen om de auditieve zenuwwortel en CN contralaterale bevatten met de MOC neuronen gericht op opnames (voorbeeld slice weergegeven in figuur 1B). Eerste histologische onderzoek van het preparaat is belangrijk om te bevestigen dat de slice bevat de kernen die nodig zijn voor circuit activering en dat axonale projecties intact zijn. Twee celtyp…

Discussion

De snijden procedure hier beschreven genoemd een wig slice is krachtig voor het behoud van intacte presynaptische neuronale circuits, maar met de toegankelijkheid van de hersenen slice experimenten voor analyse van neuronale functie. Grote zorg moet worden genomen in een aantal eerste stappen om het nut van de voorbereiding voor circuit analyse te maximaliseren. De afmetingen van de wig moeten worden bevestigd aan de hand van histologisch onderzoek, dat integraal is voor de bevestiging dat zowel presynaptische kernen als…

Materials

Experimental Preparations
Agar, powder	Fisher Scientific	BP1423500	4% agar block used to stabilize brain tissue during vibratome sectioning
AlexaFluor Hydrazide 488	Invitrogen	A10436	Fluorophore used in internal solution to confirm successful MOC neuron patch
Analytical Balance	Geneses Scientific (Intramalls)	AV114	Weighing chemicals
Double edged razor blade	Ted Pella	121-6	Vibratome cutting blade
Kynurenic acid (5g)	Sigma Aldrich	K3375-5G	Slicing ACSF additive used to reduce neuron activity during dissection and slicing in order to improve tissue health for patch clamping
pH Meter	Fisher Scientific (Intramalls)	13-620-451	Solution pH tester
Plastic petri dishes 100mm dia X 20mm	Fisher Scientific (Intramalls)	12-556-002	4% Agar Prep
Stirring Hotplate	Fisher Scientific (Intramalls)	11-500-150	Heating for 4% Agar preparation
Dissection and Slicing
Biocytin	Sigma Aldrich	B4261-250MG	Chemical used for axonal tracing (conjugated to Streptavidin 488)
Dissecting Microscope	Amscope	SM-1BN	For precision dissection during brain removal
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11252-20	Fine forceps dissection tool
Economy tweezers #3	WPI	501976	Forceps dissection tool
Glass Petri Dish 150mm dia x 15mm H	Fisher Scientific (Intramalls)	08-747E	Dissection dish
Interface paper (203 X 254mm PCTE Membrane 10um)	Thomas Scientific	1220823	Slice incubation/biocytin application
Leica VT1200S Vibratome	Leica	1491200S001	Vibratome for wedge slice sectioning
Mayo scissors	Roboz	RS-6872	Dissection tool
Single-edged carbon steel blades	Fisher Scientific (Intramalls)	12-640	Razor blade for dissection
Specimen disc, orienting	Leica	14048142068	Specialized vibratome stage for reproducible tilting
Spoonula	FisherSci	14-375-10	Dissection tool
Super Glue	Newegg	15187	Used for glueing tissue to vibratome stage
Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	91500-09	Dissection tool
Electrophysiology
A1R Upright Confocal Microscope	Nikon Instruments		Electrophysiology and imaging microscope, can be any microscope compatible with electrophysiology
Electrode Borosilicate glass w/ Filament OD 1.5mm, ID 1.1mm, 10 cm long	Sutter Instrument	BF150-110-10	Patch clamping pipette glass
Electrode Filler MicroFil	WPI	CMF20G	Patch electrode pipette filler
In-line solution heater	Warner Instruments (GSAdvantage)	SH-27B	Slice perfusion system heater
Multi-Micromanipulator Systems	Sutter Intruments	MPC-200 with MP285	Micromanipulators for patch clamp and stimulation electrode placement
P-1000 horizontal pipette puller for glass micropipettes	Sutter instruments	FG-P1000	Patch clamp pipetter puller
Patch-clamp amplifier and Software	HEKA	EPC-10 / Patchmaster Next	Can be any amplifier/software
Recording Chamber	Warner Instruments	RC26G	Slice "bath" during recording
Recording Chamber Harp	Warner Instruments	640253	Stablizes slice during electrophysiology recording
Slice Incubation Chamber	Custom Build		Heated, oxygenated holding chamber for slices during recovery after slicing
Stimulus isolation unit	A.M.P.I.	Iso-Flex	Stimulus isolation unit for electrophysiology
Syringe 60CC	Fischer Scientific (Intramalls)	14-820-11	Electrophysiology perfusion fluid handling
Temperature controller	Warner Instruments (GSAdvantage)	TC-324C	Slice perfusion system temperature controller
Tubing 1/8 OD 1/16 ID	Fischer Scientific (Intramalls)	14-171-129	Electrophysiology perfusion fluid handling
Tugsten concentric bipolar microelectrode	WPI	TM33CCINS	Stimulating electrode for electrophysiology
Histology
24 well Plate	Fisher Scientific (Intramalls)	12-556006	Histology slice collection and immunostaining
Alexa Fluor 488 Streptavidin	Jackson Immuno labs	016-540-084	Secondary antibody for biocytin visualization
Corning Orbital Shaker	Sigma	CLS6780FP	Shaker for immunohistochemistry agitation
Cresyl Violet Acetate	Sigma Aldrich (Intramalls)	C5042-10G	Cellular stain for histology
Disposable Microtome Blades	Fisher Scientific	22-210-052	Sliding microtome blade
Filter-syringe Nalgene 4mm Cellulose Acetate 0.2um	Fisher Scientific (Intramalls)	09-740-34A	Syringe filter for filling recording pipettes with internal solution
Fluoromount-G Slide Mounting Medium	Fisher Scientific	OB100-01	Immunohistochemistry fluorescence mounting medium
glass slide staining dish with rack	Fisher Scientific (Intramalls)	08-812	Cresyl Violet staining chamber
Microm HM450 Sliding Microtome	ThermoFisher	910020	Freezing microtome for histology
Microscope Cover Glasses: Rectangles 50mm X 24mm	Fisher Scientific (Intramalls)	12-543D	Histochemistry slide cover glass
Permount mounting medium	Fisher Scientific	SP15-100	Cresyl violet section mounting medium
Superfrost Slides	Fisher Scientific	22-034980	Histology slides