スプリットルシフェラーゼ相補アッセイを用いたゴルジレジデントIII型膜タンパク質によって形成される異種複合体の実証
Summary
ここで提示されたプロトコルは、スプリットルシフェラーゼ相補アッセイの最新の変異体を用いて、生きた哺乳動物細胞におけるゴルジ常駐III型膜タンパク質と細胞質的に露出したN末端および/またはC末端との間の異種相互作用の発生を実証することを意図している。
Abstract
このプロトコルの目的は、ヌクレオチド糖トランスポーター(NST)によって形成される異種複合体を実証するためのスプリットルシフェラーゼ相補の最新の変異体の適用可能性を探索することである。これらのERおよびゴルジ常駐多膜貫通タンパク質は、細胞質的に合成されたヌクレオチド糖を細胞小器官膜全体に運び、グリコシル化を媒介する酵素を基質とともに供給する。NSTは二量体および/またはそれ以上のオリゴマーとして存在する。異なるNST間の異種相互作用も報告されている。この技術がNSTヘテロマー化の現象の研究に適しているかどうかを検証するために、我々は以前にいくつかの他の手段によって会合することが示された2つのゴルジに常駐するNSTの組み合わせに対してそれを試験した。ルシフェラーゼ相補アッセイは、高い発現レベルを必要とせず、しばしばタンパク質の誤局在化を引き起こし、偽陽性のリスクを高めるため、ゴルジ体常在性膜タンパク質間の相互作用の研究に特に適しているようである。
Introduction
この原稿では、スプリットルシフェラーゼ相補アッセイの最新のバリアントを使用して、一過性にトランスフェクトされたヒト細胞におけるゴルジ体常駐III型膜タンパク質間の異種相互作用の存在をチェックするための段階的なプロトコルについて説明しています。この手順は、ヌクレオチド糖トランスポーター(NST)に対して最も広範囲に試験されていますが、N末端および/またはC末端が細胞質に面している他のゴルジ常駐III型膜タンパク質についても肯定的な結果を得ることができました。
我々の研究グループは、巨大分子のグリコシル化におけるNSTの役割を探究している。NSTはゴルジ体および/またはER常駐III型膜タンパク質であり、N末端およびC末端はオルガネラー膜の細胞質側を向いています1。NSTは、糖転移酵素に基質を供給するために、オルガネラ膜を横切ってヌクレオチド活性化糖を運ぶと考えられている。NSTは二量体および/またはそれ以上のオリゴマー2、3、4、5、6、7、8、9、10を形成する。さらに、異なるNST間の異種相互作用も報告されている6,11。NSTはまた、機能的に関連するグリコシル化酵素との複合体を形成することが実証された12、13、14。私たちは、NSTと機能的に関連するゴルジ体常駐タンパク質の相互作用を研究するために、現在使用されている蛍光寿命イメージング(FLIM)ベースのFRETアプローチに代わるものを探し、スプリットルシフェラーゼ相補アッセイをテストすることに決めました。これにより、NSTと機能的に関連するグリコシル化酵素との間の新しい相互作用を同定することができました9。
スプリットルシフェラーゼ相補アッセイの最新の改変であるNanoBiTは、ここで提示されたプロトコルで使用されています15。これは、2つの断片からのルシフェラーゼ酵素(例えば、NanoLuc)の再構成に依存している – 大きなBiTまたはLgBiTと呼ばれる大きなもの、17.6kDaのタンパク質、および小さなBiTまたはSmBiTと呼ばれる11個のアミノ酸のみで構成される小さなもの。目的の2つのタンパク質を相補的断片と融合させ、ヒト細胞株中で一過性に発現させる。2つの融合タンパク質が相互作用する場合、細胞透過性基質の添加時にその場で発光が生成される。これら2つの断片は、それらが融合している目的のタンパク質間の相互作用によって一緒にされない限り、それらが最小の親和性で会合するように最適化されている。
一般に、生物発光ベースの方法は、蛍光に基づく方法よりもいくつかの利点を有する。生物発光シグナルは、バックグラウンド発光がルシフェラーゼ由来のシグナルと比較して無視できる程度であるため、より高いシグナル対ノイズ比を有する16。対照的に、蛍光ベースのアプローチは、通常、自己蛍光の現象によって引き起こされる比較的高いバックグラウンドに苦しむ。その上、生物発光は蛍光よりも分析された細胞にとって有害性が低く、前者の場合のように試料を励起する必要はない。これらの理由から、インビボでPPIを研究するための生物発光アプローチは、フェルスター共鳴エネルギー移動(FRET)や二分子蛍光相補(BiFC)などの一般的に使用される蛍光法よりも競合します。
我々のプロトコールは、目的のタンパク質組み合わせについて得られた発光を、対照の組み合わせについて得られた発光に参照することに依存している。後者は、より大きな断片と融合された試験されたタンパク質の1つと、より小さな断片と融合された対照タンパク質(例えば、HaloTag)とを含む。後者は、哺乳類のタンパク質のいずれとも相互作用するとは予想されない細菌起源のタンパク質である。このタンパク質を対照として使用すると、分析されるゴルジ常駐タンパク質の対のトポロジーに制限が生じる。哺乳動物細胞ではこのタンパク質は細胞質内で合成されるので、目的の両方のタンパク質は少なくとも1つの細胞質尾部を有するべきである。
このアプローチは、PPIの初期スクリーニングに特に有用であり得る。これは、目的の融合タンパク質が、他のアプローチを適用するには単に不十分なレベルで発現される場合に、選択の方法となり得る。同様に、分割ルシフェラーゼ相補アッセイは、目的のタンパク質が高レベルで発現している場合に最良の選択肢となり得るが、これはそれらの細胞内局在化に悪影響を及ぼすか、または非特異的相互作用を強制することが知られている。より小さい断片は11個のアミノ酸しか有さないので、より大きなタグを使用するのが不可能である場合に分割ルシフェラーゼ相補アッセイを適用することができる。最後に、ここで提示する場合のように、他の技術を用いて得られたデータをさらに確認するために採用することができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、分割ルシフェラーゼ相補アッセイを使用して、NSTなどのゴルジ常駐III型膜タンパク質間に形成される異種複合体の実証を可能にする詳細なプロトコルを提供します。データ解析および解釈への提案されたアプローチは、目的のタンパク質の組み合わせについて得られた発光を、より大きな断片と融合した目的のタンパク質の1つおよびより小さい断片と融合した細菌起源の制御タン…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、ポーランドのクラクフにある国立科学センター(NCN)からの助成金番号2016/23/D/NZ3/01314によって支援されました。
Materials
| 0.25% trypsin-EDTA solution | |||
| Adherent mammalian cell line | |||
| BioCoat Poly-D-Lysine 96-well White/Clear Flat Bottom TC-treated Microplate, with Lid | Corning | 356651 | |
| Cell culture centrifuge | |||
| Cell culture supplements (heat-inactivated fetal bovine serum, L-glutamine, penicillin, streptamycin) | |||
| CO2 incubator | |||
| Expression plasmids encoding protein(s) of interest not tagged with NanoBiT fragments | |||
| FuGENE HD Transfection Reagent | Promega | E2311 | |
| GloMax Discover Microplate Reader (or a different luminescence microplate reader) | Promega | GM3000 | |
| Growth medium dedicated to the cell line used | |||
| Materials and reagents for standard molecular cloning (bacteria, thermostable polymerase, restriction enzymes, DNA ligase, materials and reagents for nucleic acid purification) | |||
| NanoBiT MCS Starter System | Promega | N2014 | This kit contains vectors enabling tagging of the proteins of interest with NanoBiT fragments at different orientations as well as the control plasmid encoding HaloTag protein fused with SmBiT and a positive control plasmid pair. |
| Nano-Glo Live Cell Assay System | Promega | N2011 | This kit contains furimazine, which is a substrate enabling detection of the NanoLuc activity in living cells, and a dedicated dilution buffer. |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium, no phenol red | Gibco | 11058021 | |
| Oribital shaker | |||
| Software for data analysis (e.g. GraphPad Prism) | |||
| Thermocycler |
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