Demonstrasjon av heteroologe komplekser dannet av Golgi-Resident Type III Membranproteiner ved hjelp av Split Luciferase Complementation Assay

Summary

Protokollen som presenteres her er ment å demonstrere forekomsten av heteroologe interaksjoner mellom Golgi-bosatte type III membranproteiner med cytoplasmatisk eksponert N- og / eller C-termini i levende pattedyrceller ved hjelp av den nyeste varianten av den delte luciferase komplementeringsanalysen.

Abstract

Målet med denne protokollen er å utforske anvendelsen av den nyeste varianten av delt luciferase komplementering for å demonstrere heteroologe komplekser dannet av nukleotid sukkertransportører (NSTs). Disse ER- og Golgi-bosatte multitransmembrane proteinene bærer cytoplasmatisk syntetiserte nukleotidsukker på tvers av organellemembraner for å levere enzymer som formidler glykosylering med deres substrater. NSTer finnes som dimers og/eller høyere oligomerer. Det er også rapportert om heterologe interaksjoner mellom ulike NST-er. For å verifisere om teknikken er egnet for å studere fenomenet NST-hetermerisering, testet vi den mot en kombinasjon av de to Golgi-bosatte NSTene som tidligere har vist seg å assosiere på flere andre måter. Luciferase komplementeringsanalysen ser ut til å være spesielt egnet for å studere interaksjoner mellom Golgi-bosatte membranproteiner, da det ikke krever høye uttrykksnivåer, som ofte utløser protein feillokalisering og øker risikoen for falske positiver.

Introduction

Dette manuskriptet beskriver en trinnvis protokoll for å se etter tilstedeværelsen av heterologe interaksjoner mellom Golgi-resident type III membranproteiner i forbigående transfekerte menneskelige celler ved hjelp av den nyeste varianten av den delte luciferase komplementeringsanalysen. Prosedyren har blitt mest omfattende testet mot nukleotid sukkertransportører (NSTs), men vi var også i stand til å oppnå positive resultater for andre Golgi-bosatte type III membranproteiner hvis N- og / eller C-termini står overfor cytoplasma.

Vår forskningsgruppe utforsker NSTs rolle i glykosylering av makromolekyler. NSTs er Golgi- og/eller ER-bosatte type III membranproteiner med N- og C-termini vendt mot den cytoplasmatiske siden av organellarmembranen1. NSTs antas å bære nukleotidaktiverte sukkerarter over organellemembraner for å levere glykosyltransferaser med sine substrater. NSTer danner dimers og/eller høyere oligomers2,3,4,5,6,7,8,9,10. Videre er det også rapportert heteroologe interaksjoner mellom ulike NST-er^{, 6,11}. NSTs ble også demonstrert for å danne komplekser med funksjonelt relaterte glykosyleringsenzymer12,13,14. Vi søkte etter et alternativ til den nåværende brukte teknikken, fluorescens levetidsavbildning (FLIM)-basert FRET-tilnærming, for å studere interaksjoner mellom NSTs og funksjonelt relaterte Golgi-bosatte proteiner, så vi bestemte oss for å teste den splittede luciferase komplementeringsanalysen. Det tillot oss å identifisere et nytt samspill mellom en NST og et funksjonelt relatert glykosyleringsenzym9.

Den siste modifikasjonen av den delte luciferase komplementeringsanalysen, NanoBiT, brukes i protokollen som presenteres ^her15. Det er avhengig av rekonstituering av luciferase enzymet (f.eks. NanoLuc) fra de to fragmentene – den store, betegnet som stor BiT eller LgBiT, et 17,6 kDa protein, og den lille, bestående av bare 11 aminosyrer, betegnet som liten BiT eller SmBiT. De to proteinene av interesse er smeltet sammen med komplementære fragmenter og midlertidig uttrykt i en menneskelig cellelinje. Hvis de to fusjonsproteinene samhandler, produseres en luminescens in situ ved tilsetning av et cellegjennomtrengelig substrat. Disse to fragmentene er optimalisert slik at de forbinder med minimum affinitet med mindre de blir samlet av et samspill mellom proteinene av interesse de er smeltet sammen til.

Generelt har bioluminescensbaserte metoder noen fordeler i forhold til de som er basert på fluorescens. Bioluminescence-signaler har et høyere signal-til-støy-forhold fordi bakgrunnslysene er ubetydelige sammenlignet med det luciferase-avledede ^signalet16. I motsetning lider fluorescensbaserte tilnærminger vanligvis av en relativt høy bakgrunn forårsaket av fenomenet autofluorescens. Dessuten er bioluminescens mindre skadelig for de analyserte cellene enn fluorescens, som i det tidligere tilfellet er det ikke nødvendig å begeistre prøven. Av disse grunnene bioluminescent tilnærminger til å studere PPIs in vivo outkompetente de ofte brukte fluorescerende metoder som Förster Resonance Energy Transfer (FRET) eller Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC).

Vår protokoll er avhengig av å referere luminescens oppnådd for proteinkombinasjonen av interesse for luminescens oppnådd for kontrollkombinasjonen. Sistnevnte inkluderer et av de testede proteinene som er smeltet sammen med et større fragment og et kontrollprotein (f.eks. HaloTag), smeltet sammen med et mindre fragment. Sistnevnte er et protein av bakteriell opprinnelse som ikke forventes å samhandle med noen av pattedyrproteiner. Å bruke dette proteinet som en kontroll gir begrensninger for topologien til de Golgi-bosatte par proteinene som skal analyseres. Siden i pattedyrceller syntetiseres dette proteinet i cytoplasma, bør begge proteiner av interesse ha minst en cytoplasmatisk hale.

Denne tilnærmingen kan være spesielt nyttig for første screening av PPIer. Det kan bli den valgte metoden når fusjonsproteinene av interesse uttrykkes på nivåer som rett og slett ikke er tilstrekkelige for andre tilnærminger som skal brukes. På samme måte kan den delte luciferase komplementeringsanalysen være det beste alternativet hvis proteinene av interesse uttrykkes på høye nivåer, men dette påvirker deres subcellulære lokalisering negativt eller er kjent for å tvinge ikke-spesifikke interaksjoner. Siden det mindre fragmentet bare har 11 aminosyrer, kan den delte luciferase komplementeringsanalysen påføres når du bruker større koder er umulig. Til slutt kan den brukes til å bekrefte data som er innhentet ved hjelp av andre teknikker, som i tilfelle presentert her.

Protocol

1. Generering av uttrykksplasmider Undersøk membrantopologien til proteinene av interesse ved hjelp av et topologiforutsigelsesverktøy. Design kloningsstrategien slik at de større og mindre fragmentene vil møte cytoplasma når fusjonsproteinene er satt inn i Golgi-membraner. Hvis, som i tilfellet presentert her, både N- og C-termini av proteinene av interesse er cytoplasmisk orientert, merke proteinene på åtte mulige måter (se figur 1B). Hvis N- eller C-terminus a…

Representative Results

For å oppnå de mest pålitelige dataene i denne tilnærmingen bør alle mulige kombinasjoner testes (se figur 1). Parallelt bør positive og negative kontroller inkluderes. Den positive kontrollen skal bestå av de to proteinene som er kjent for å samhandle, hvorav den ene er smeltet sammen med det større fragmentet og den andre er smeltet sammen med det mindre fragmentet. Den negative kontrollen bør ideelt sett bestå av de to ikke-interagerende type III membranproteinene merket på sa…

Discussion

Her gir vi en detaljert protokoll som muliggjør demonstrasjon av heteroologe komplekser dannet mellom Golgi-bosatte type III membranproteiner, som NSTs, ved hjelp av den delte luciferase komplementeringsanalysen. Den foreslåtte tilnærmingen til dataanalyse og tolkning innebærer å relatere luminescensen oppnådd for proteinkombinasjonen av interesse for luminescensen oppnådd for den tilsvarende kontrollkombinasjonen, som består av et av proteinene av interesse smeltet sammen med det større fragmentet og kontrollpr…

Materials

0.25% trypsin-EDTA solution
Adherent mammalian cell line
BioCoat Poly-D-Lysine 96-well White/Clear Flat Bottom TC-treated Microplate, with Lid	Corning	356651
Cell culture centrifuge
Cell culture supplements (heat-inactivated fetal bovine serum, L-glutamine, penicillin, streptamycin)
CO2 incubator
Expression plasmids encoding protein(s) of interest not tagged with NanoBiT fragments
FuGENE HD Transfection Reagent	Promega	E2311
GloMax Discover Microplate Reader (or a different luminescence microplate reader)	Promega	GM3000
Growth medium dedicated to the cell line used
Materials and reagents for standard molecular cloning (bacteria, thermostable polymerase, restriction enzymes, DNA ligase, materials and reagents for nucleic acid purification)
NanoBiT MCS Starter System	Promega	N2014	This kit contains vectors enabling tagging of the proteins of interest with NanoBiT fragments at different orientations as well as the control plasmid encoding HaloTag protein fused with SmBiT and a positive control plasmid pair.
Nano-Glo Live Cell Assay System	Promega	N2011	This kit contains furimazine, which is a substrate enabling detection of the NanoLuc activity in living cells, and a dedicated dilution buffer.
Opti-MEM I Reduced Serum Medium, no phenol red	Gibco	11058021
Oribital shaker
Software for data analysis (e.g. GraphPad Prism)
Thermocycler