Nachweis heterologer Komplexe, die von Golgi-residenten Typ-III-Membranproteinen gebildet werden, mittels Split-Luciferase-Komplementierungsassay

Summary

Das hier vorgestellte Protokoll soll das Auftreten heterologer Interaktionen zwischen Golgi-residenten Typ-III-Membranproteinen mit zytoplasmatisch exponierten N- und/oder C-Termini in lebenden Säugetierzellen unter Verwendung der neuesten Variante des Split-Lucifererase-Komplementierungsassays demonstrieren.

Abstract

Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Anwendbarkeit der neuesten Variante der gespaltenen Luciferase-Komplementierung für den Nachweis heterologer Komplexe, die von Nukleotid-Zuckertransportern (NSTs) gebildet werden, zu untersuchen. Diese ER- und Golgi-residenten Multitransmembranproteine transportieren die zytoplasmatisch synthetisierten Nukleotidzucker über Organellenmembranen, um Enzyme zu liefern, die die Glykosylierung mit ihren Substraten vermitteln. NSTs existieren als Dimere und/oder höhere Oligomere. Heterologe Wechselwirkungen zwischen verschiedenen NSTs wurden ebenfalls berichtet. Um zu überprüfen, ob die Technik für die Untersuchung des Phänomens der NST-Heteromerisierung geeignet ist, haben wir sie gegen eine Kombination der beiden Golgi-ansässigen NSTs getestet, von denen zuvor gezeigt wurde, dass sie sich auf verschiedene andere Weise assoziieren. Der Luciferase-Komplementierungsassay scheint besonders geeignet zu sein, um Wechselwirkungen zwischen Golgi-residenten Membranproteinen zu untersuchen, da er keine hohen Expressionsniveaus erfordert, die oft eine Proteinfehllokalisation auslösen und das Risiko von falsch positiven Ergebnissen erhöhen.

Introduction

Dieses Manuskript beschreibt ein Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Überprüfung auf das Vorhandensein heterologer Interaktionen zwischen Golgi-residenten Typ-III-Membranproteinen in transient transfizierten menschlichen Zellen unter Verwendung der neuesten Variante des Split-Lucifererase-Komplementierungsassays. Das Verfahren wurde am umfangreichsten gegen Nukleotid-Zuckertransporter (NSTs) getestet, aber wir konnten auch positive Ergebnisse für andere Golgi-residente Typ-III-Membranproteine erzielen, deren N- und/oder C-Termini dem Zytoplasma zugewandt sind.

Unsere Forschungsgruppe untersucht die Rolle von NSTs bei der Glykosylierung von Makromolekülen. NSTs sind Golgi- und/oder ER-residente Typ-III-Membranproteine mit N- und C-Termini, die der zytoplasmatischen Seite der Organellamembran zugewandt ^sind1. Es wird angenommen, dass NSTs nukleotidaktivierte Zucker über Organellenmembranen transportieren, um Glykosyltransferasen mit ihren Substraten zu versorgen. NSTs bilden Dimere und/oder höhere Oligomere2,3,4,5,6,7,8,9,10. Darüber hinaus wurden auch heterologe Wechselwirkungen zwischen verschiedenen NSTs ^{berichtet6,11}. Es wurde auch gezeigt, dass NSTs Komplexe mit funktionell verwandten Glykosylierungsenzymen bilden12,13,14. Wir suchten nach einer Alternative zur derzeit verwendeten Technik, dem FLIM-basierten FRET-Ansatz (Fluorescence Lifetime Imaging), um die Wechselwirkungen von NSTs und funktionell verwandten Golgi-residenten Proteinen zu untersuchen, also beschlossen wir, den Split-Luciferase-Komplementierungsassay zu testen. Es ermöglichte uns, eine neuartige Wechselwirkung zwischen einem NST und einem funktionell verwandten Glykosylierungsenzym zu ^{identifizieren9}.

Die jüngste Modifikation des Split-Luciferase-Komplementierungsassays NanoBiT wird in dem hier ^{vorgestellten Protokoll verwendet15}. Es beruht auf der Rekonstitution des Luciferase-Enzyms (z. B. NanoLuc) aus den beiden Fragmenten – dem großen, das als großes BiT oder LgBiT bezeichnet wird, einem 17,6-kDa-Protein, und dem kleinen, das aus nur 11 Aminosäuren besteht, das als kleines BiT oder SmBiT bezeichnet wird. Die beiden interessierenden Proteine werden mit den komplementären Fragmenten verschmolzen und vorübergehend in einer menschlichen Zelllinie exprimiert. Wenn die beiden Fusionsproteine interagieren, entsteht in situ durch Zugabe eines zelldurchlässigen Substrats eine Lumineszenz. Diese beiden Fragmente wurden so optimiert, dass sie sich mit minimaler Affinität assoziieren, es sei denn, sie werden durch eine Wechselwirkung zwischen den Proteinen von Interesse, mit denen sie verschmolzen sind, zusammengebracht.

Im Allgemeinen haben biolumineszenzbasierte Methoden einige Vorteile gegenüber denen, die auf Fluoreszenz basieren. Biolumineszenzsignale haben ein höheres Signal-Rausch-Verhältnis, da die Hintergrundlumineszenz im Vergleich zum Luciferase-abgeleiteten ^Signal16 vernachlässigbar ist. Im Gegensatz dazu leiden fluoreszenzbasierte Ansätze in der Regel unter einem relativ hohen Hintergrund, der durch das Phänomen der Autofluoreszenz verursacht wird. Außerdem ist die Biolumineszenz für die analysierten Zellen weniger schädlich als die Fluoreszenz, da im ersten Fall keine Notwendigkeit besteht, die Probe anzuregen. Aus diesen Gründen übertreffen biolumineszierende Ansätze zur Untersuchung von PPIs in vivo die häufig verwendeten fluoreszierenden Methoden wie Förster Resonance Energy Transfer (FRET) oder Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC).

Unser Protokoll beruht auf der Bezugnahme der Lumineszenz, die für die Proteinkombination von Interesse ist, auf die Lumineszenz, die für die Kontrollkombination erhalten wird. Letzteres umfasst eines der getesteten Proteine, das mit einem größeren Fragment verschmolzen ist, und ein Kontrollprotein (z. B. HaloTag), das mit einem kleineren Fragment verschmolzen ist. Letzteres ist ein Protein bakteriellen Ursprungs, von dem nicht erwartet wird, dass es mit einem der Säugetierproteine interagiert. Die Verwendung dieses Proteins als Kontrolle schränkt die Topologie der zu analysierenden Golgi-residenten Proteinpaare ein. Da dieses Protein in Säugetierzellen im Zytoplasma synthetisiert wird, sollten beide interessierenden Proteine mindestens einen zytoplasmatischen Schwanz haben.

Dieser Ansatz kann besonders nützlich für das anfängliche Screening von PPIs sein. Es kann die Methode der Wahl werden, wenn die interessierenden Fusionsproteine in Konzentrationen ausgedrückt werden, die für die Anwendung anderer Ansätze einfach nicht ausreichen. In ähnlicher Weise kann der Split-Luciferase-Komplementierungsassay die beste Option sein, wenn die interessierenden Proteine in hohen Konzentrationen exprimiert werden, was sich jedoch nachteilig auf ihre subzelluläre Lokalisation auswirkt oder dafür bekannt ist, unspezifische Wechselwirkungen zu erzwingen. Da das kleinere Fragment nur 11 Aminosäuren enthält, kann der Split-Luciferase-Komplementierungsassay angewendet werden, wenn die Verwendung größerer Tags unmöglich ist. Schließlich kann es verwendet werden, um Daten, die mit anderen Techniken erhalten wurden, wie in dem hier vorgestellten Fall, weiter zu bestätigen.

Protocol

1. Erzeugung von Expressionsplasmiden Untersuchen Sie die Membrantopologie der interessierenden Proteine mit einem Topologievorhersagewerkzeug. Entwerfen Sie die Klonierungsstrategie so, dass die größeren und kleineren Fragmente dem Zytoplasma gegenüberstehen, sobald die Fusionsproteine in die Golgi-Membranen eingefügt wurden. Wenn, wie im hier dargestellten Fall, sowohl N- als auch C-Termini der interessierenden Proteine zytoplasmatisch orientiert sind, markieren Sie die Proteine auf acht möglic…

Representative Results

Um die zuverlässigsten Daten in diesem Ansatz zu erhalten, sollten alle möglichen Kombinationen getestet werden (siehe Abbildung 1). Parallel dazu sollten Positiv- und Negativkontrollen einbezogen werden. Die Positivkontrolle sollte aus den beiden Proteinen bestehen, von denen bekannt ist, dass sie interagieren, von denen eines mit dem größeren Fragment und das andere mit dem kleineren Fragment verschmolzen ist. Die Negativkontrolle sollte idealerweise aus den beiden nicht interagierende…

Discussion

Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Verfügung, das den Nachweis heterologer Komplexe ermöglicht, die zwischen Golgi-residenten Typ-III-Membranproteinen wie NSTs gebildet werden, indem wir den Split-Luciferase-Komplementierungsassay verwenden. Der vorgeschlagene Ansatz zur Datenanalyse und -interpretation besteht darin, die für die interessierende Proteinkombination erhaltene Lumineszenz mit der für die entsprechende Kontrollkombination erhaltenen Lumineszenz in Beziehung zu setzen, die aus einem der inte…

Materials

0.25% trypsin-EDTA solution
Adherent mammalian cell line
BioCoat Poly-D-Lysine 96-well White/Clear Flat Bottom TC-treated Microplate, with Lid	Corning	356651
Cell culture centrifuge
Cell culture supplements (heat-inactivated fetal bovine serum, L-glutamine, penicillin, streptamycin)
CO2 incubator
Expression plasmids encoding protein(s) of interest not tagged with NanoBiT fragments
FuGENE HD Transfection Reagent	Promega	E2311
GloMax Discover Microplate Reader (or a different luminescence microplate reader)	Promega	GM3000
Growth medium dedicated to the cell line used
Materials and reagents for standard molecular cloning (bacteria, thermostable polymerase, restriction enzymes, DNA ligase, materials and reagents for nucleic acid purification)
NanoBiT MCS Starter System	Promega	N2014	This kit contains vectors enabling tagging of the proteins of interest with NanoBiT fragments at different orientations as well as the control plasmid encoding HaloTag protein fused with SmBiT and a positive control plasmid pair.
Nano-Glo Live Cell Assay System	Promega	N2011	This kit contains furimazine, which is a substrate enabling detection of the NanoLuc activity in living cells, and a dedicated dilution buffer.
Opti-MEM I Reduced Serum Medium, no phenol red	Gibco	11058021
Oribital shaker
Software for data analysis (e.g. GraphPad Prism)
Thermocycler