Trapianto sottoretinico di tessuto retinico derivato da cellule staminali embrionali umane in un modello animale felino di grandi dimensioni
Summary
Qui viene presentata una tecnica chirurgica per il trapianto di tessuto retinico derivato da cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) nello spazio sottoretinico di un grande modello animale.
Abstract
Le condizioni degenerative della retina (RD) associate alla perdita dei fotorecettori come la degenerazione maculare legata all’età (AMD), la retinite pigmentosa (RP) e l’amaurosi congenita di Leber (LCA) causano una perdita progressiva e debilitante della vista. C’è un bisogno insoddisfatto di terapie in grado di ripristinare la visione una volta che i fotorecettori sono stati persi. Il trapianto di tessuto retinico derivato da cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) (organoidi) nello spazio sottoretinico di un occhio con RD avanzata porta fogli di tessuto retinico con migliaia di fotorecettori sani privi di mutazioni e ha il potenziale per trattare la maggior parte / tutte le malattie accecanti associate alla degenerazione dei fotorecettori con un protocollo approvato. Il trapianto di tessuto retinico fetale nello spazio sottoretinico di modelli animali e persone con RD avanzata è stato sviluppato con successo, ma non può essere utilizzato come terapia di routine a causa di preoccupazioni etiche e limitato apporto di tessuti. I modelli animali di degenerazione retinica ereditaria (IRD) dei grandi occhi sono preziosi per lo sviluppo di terapie di ripristino della vista che utilizzano approcci chirurgici avanzati per trapiantare cellule / tessuti retinici nello spazio sottoretinico. Le somiglianze nelle dimensioni del globo e nella distribuzione dei fotorecettori (ad esempio, la presenza di un’area centrale della regione simile alla macula) e la disponibilità di modelli IRD che ricapitolino strettamente l’IRD umana faciliterebbero la rapida traduzione di una terapia promettente alla clinica. Qui viene presentata una tecnica chirurgica di trapianto di tessuto retinico derivato da hPSC nello spazio sottoretinico di un grande modello animale che consente la valutazione di questo approccio promettente in modelli animali.
Introduction
Milioni di persone in tutto il mondo sono colpite dalla degenerazione retinica (RD) con conseguente compromissione visiva o cecità associata alla perdita dei fotorecettori sensibili alla luce (PR). La degenerazione maculare legata all’età (AMD) è una delle principali cause di cecità derivante da una combinazione di fattori di rischio genetici e fattori ambientali / stile di vita. Inoltre, oltre 200 geni e loci sono stati trovati per causare RD ereditaria (IRD)1. La retinite pigmentosa (RP), l’IRD più comune, è geneticamente eterogenea con più di 3.000 mutazioni genetiche in circa 70 geni segnalati 2,3,4. Anche l’amaurosi congenita di Leber (LCA), che causa cecità nell’infanzia, è geneticamente eterogenea 5,6. La terapia di aumento genico è stata sviluppata ed è in studi clinici per il trattamento di un piccolo numero di IRD 3,7. Tuttavia, deve essere sviluppata una terapia separata per il trattamento di ciascuna forma genetica distinta di IRD e quindi trattare solo un piccolo sottogruppo di pazienti. Inoltre, l’aumento genico si basa sulla presenza di una popolazione di fotorecettori salvabili e, pertanto, non è applicabile per la degenerazione avanzata.
Vi è, quindi, un bisogno clinico urgente e ancora insoddisfatto per lo sviluppo di terapie che affrontino e trattino le RD avanzate e la cecità da profonda a terminale. Negli ultimi 2 decenni gli impianti neuroprotesici sono stati sviluppati e testati in modelli animali di grandi dimensioni, come il gatto, prima dell’uso umano 8,9,10,11,12,13,14. Allo stesso modo, negli ultimi 20 anni sono state sviluppate terapie di sostituzione della retina retinica di mammiferi embrionali o addirittura mature innestate sottoretiniche 15,16,17,18,19,20,21,22 e persino testate con successo in pazienti con RD 23,24,25. Entrambi gli approcci utilizzano l’idea di introdurre nuovi sensori (fotodiodi fotovoltaici al silicio nel caso di dispositivi neuroprotesici26,27 e fotorecettori sani privi di mutazioni organizzati in fogli, nel caso di impianto di fogli retinici) nella retina con PR degenerati. Studi recenti hanno studiato l’uso di approcci basati su cellule staminali come il trapianto di progenitori retinici derivati da cellule staminali pluripotenti umane (hPSC)28,29, fotorecettori hPSC 30 e organoidi retinici hPSC31,32,33. Gli organoidi retinici consentono la formazione di tessuto retinico in un piatto e la derivazione di fogli fotorecettori con migliaia di PR privi di mutazione, che assomigliano allo strato di fotorecettori nella retina fetale umana in via di sviluppo 34,35,36,37,38,39,40. Il trapianto di tessuto retinico derivato da hPSC (organoidi) nello spazio sottoretinico di pazienti con condizioni di RD è uno dei nuovi e promettenti approcci di terapia cellulare sperimentale, perseguito da un certo numero di team31,32,41,42. Rispetto al trapianto della sospensione cellulare (di giovani fotorecettori o progenitori della retina), è stato dimostrato che fogli trapiantati di fotorecettori fetali determinano miglioramenti della vista negli studi clinici23,24.
Il protocollo qui presentato descrive, in dettaglio, una procedura di trapianto per la consegna sottoretinica dell’intero organoide retinico (piuttosto che dei bordi organoidi33,41) come un modo potenzialmente migliore per introdurre fogli retinici intatti con PR, per aumentare la sopravvivenza dell’innesto e migliorare la conservazione del foglio. Sebbene le procedure per l’introduzione di un pezzo piatto di retina umana e anche di cerotti RPE siano stati sviluppati43,44,45, il trapianto di innesti 3D più grandi non è stato studiato. Gli organoidi retinici derivati dalle cellule staminali forniscono una fonte inesauribile di fogli fotorecettori per lo sviluppo di tecnologie di ripristino della vista, sono privi di restrizioni etiche e sono considerati un’eccellente fonte di tessuto retinico umano per terapie incentrate sul trattamento della RD avanzata e della cecità terminale46. Lo sviluppo di metodi chirurgici per l’impianto sottoretinico preciso di organoidi retinici con lesioni minime alla nicchia retinica dell’ospite (retina neurale, epitelio pigmentato retinico e vascolarizzazione retinica e coroideale) è uno dei passi critici per far avanzare tale terapia verso applicazioni cliniche31,32. Grandi modelli animali come gatti, cani, maiali e scimmie hanno dimostrato di essere buoni modelli per studiare i metodi di consegna chirurgica e per dimostrare la sicurezza di fogli di tessuto impiantati (cellule dell’epitelio pigmentato retinico (RPE)) e studiare l’uso di organoidi 41,44,45,47,48,49,50 . Il grande occhio animale ha dimensioni del globo simili a quelle umane e un’anatomia simile, compresa la presenza di una regione ad alta densità di fotorecettori, compresi i coni (l’area centrale), simile alla macula umana 6,51,52.
In questo manoscritto viene descritta una tecnica per l’impianto di tessuto retinico derivato da hPSC (organoidi) nello spazio sottoretinico di modelli animali felini di grandi dimensioni (sia gatti wild-type che CrxRdy / +), che, insieme a risultati di efficacia promettenti32,53, costruisce una base per l’ulteriore sviluppo di tale terapia sperimentale verso applicazioni cliniche per il trattamento di condizioni RD.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’impianto di tessuto retinico derivato da hPSC (organoidi retinici) nello spazio sottoretinico è un approccio sperimentale promettente per ripristinare la vista per le malattie degenerative retiniche in stadio avanzato causate dalla morte delle cellule PR (cecità profonda o terminale). L’approccio presentato si basa su una terapia sperimentale precedentemente sviluppata e testata con successo basata sull’innesto sottoretinico di un pezzo di tessuto retinico fetale umano23,24,25<sup c…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato finanziato dalla sovvenzione NEI Fast-track SBIR R44-EY027654-01A1 e dalla sovvenzione SBIR 3 R44 EY 027654 – 02 S1 (I.O.N., Lineage Cell Therapeutics; Dr. Petersen-Jones è un co-PI). Gli autori desiderano ringraziare la signora Janice Querubin (MSU RATTS) per il suo aiuto con l’anestesia e la cura generale per gli animali inclusi in questo studio, nonché l’aiuto con l’impostazione chirurgica e la preparazione / sterilizzazione degli strumenti. Gli autori desiderano ringraziare la dottoressa Paige Winkler per l’aiuto nel ricevere gli organoidi e metterli nei media il giorno prima dell’impianto e per l’aiuto il giorno dell’impianto. Gli autori sono anche grati al signor Randy Garchar (LCTX) per la spedizione diligente di organoidi retinici, assemblando lo spedizioniere e scaricando i record di temperatura e stress G dopo ogni spedizione. Questo lavoro è stato eseguito mentre l’autore Igor Nasonkin era impiegato da Biotime (ora Lineage).
Materials
| 0.22 µm pore syringe filter with PES membrane | Cameo | NA | can be found by various suppliers |
| 23G subretinal injector with extendable 41 G cannula | DORC | 1270.EXT | |
| 250 µL hamilton gas tight luer lock syringe | Hamilton | NA | can be found by various suppliers |
| 6-0 Silk suture | Ethicon | 707G | |
| 6-0/7-0 polyglactin suture | Ethicon | J570G | |
| Acepromazine maleate 500mg/5mL (Aceproject) | Henry Schein Animal Health | NA | can be found by various suppliers |
| Buprenorphine 0.3 mg/mL | Par Pharmaceutical | NA | can be found by various suppliers |
| cSLO + SD-OCT | Heidelberg Engineering | Spectralis HRA+ OCT | |
| Cyclosporine | Novartis | NA | can be found by various suppliers |
| Dexamethasone 2mg/mL (Azium) | Vetone | NA | can be found by various suppliers |
| Doxycyline 25mg/5mL | Cipla | NA | can be found by various suppliers |
| Fatal Plus solution (pentobarnital solution) | Vortech | NA | can be found by various suppliers |
| Gentamicin 20mg/2mL | Hospira | NA | can be found by various suppliers |
| Glass capillary (Thin-Wall Single-Barrel Standard Borosilicate (Schott Duran) Glass Tubing | World Precision Instruments | TW150-4 | |
| Methylprednisolone actetate 40 mg/mL | Pfizer | NA | can be found by various suppliers |
| Microscope | Zeiss | NA | |
| OCT medium (Tissue-Tek O.C.T. Compound) | Sakura | 4583 | |
| Olympic Vac-Pac Size 23 | Natus | NA | can be found by various suppliers |
| Paraformaldehyde 16% solution | EMS | 15719 | |
| Phenylephrine Hydrochloride 10% Ophthalmic Solution | Akorn | NA | can be found by various suppliers |
| Prednisolone 15mg/5mL | Akorn | NA | can be found by various suppliers |
| Propofol 5000mg/50mL (10 mg/mL) (PropoFlo28) | Zoetis | NA | can be found by various suppliers |
| RetCam II video fundus camera | Clarity Medical Systems | NA | can be found by various suppliers |
| Triamcinolone 400mg/10 mL (Kenalog-40) | Bristol -Myers Squibb Company | NA | can be found by various suppliers |
| Tropicamide 1% ophthalmic solution | Akorn | NA | can be found by various suppliers |
| Vitrectomy 23G port | Alcon | Accurus systems | |
| Vitrectomy machine | Alcon | Accurus systems | |
| Vitreo-retinal vertical 80° scissors with squeeze handle | Frimen | FT170206T |
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