מדידה של הפצות לחות תלת-ממדיות בתאים חיים באמצעות הדמיה וניתוח FRET היפרספקטרליים
Summary
בשל יחס אות לרעש נמוך (SNR) של חיישנים מבוססי העברת אנרגיית תהודה של Fӧrster (FRET), מדידת אותות המחנה הייתה מאתגרת, במיוחד בשלושה ממדים מרחביים. כאן, אנו מתארים מתודולוגיית דימות וניתוח FRET היפרספקטרלית המאפשרת מדידה של התפלגות המחנה בשלושה ממדים מרחביים.
Abstract
AMP מחזורי הוא שליח שני המעורב במגוון רחב של פעילויות תאיות ופיזיולוגיות. מספר מחקרים מצביעים על כך שאותות המחנה ממודרים, וכי המידור תורם לאותת על הספציפיות בתוך מסלול האיתות של המחנה. הפיתוח של biosensors מבוססי העברת אנרגיה תהודה Fӧrster (FRET) קידם את היכולת למדוד ולדמיין אותות cAMP בתאים. עם זאת, מדידות אלה מוגבלות לעתים קרובות לשני ממדים מרחביים, מה שעלול לגרום לפרשנות שגויה של נתונים. עד כה, היו רק מדידות מוגבלות מאוד של אותות המחנה בשלושה ממדים מרחביים (x, Y ו- z), בשל המגבלות הטכניות בשימוש בחיישני FRET המציגים מטבעם יחס אות לרעש נמוך (SNR). בנוסף, גישות הדמיה מסורתיות המבוססות על מסנן אינן יעילות לעתים קרובות למדידה מדויקת של אותות המחנה באזורים תת-תאיים מקומיים בשל מגוון גורמים, כולל הצלבה ספקטרלית, עוצמת אות מוגבלת ופלואורסצנטיות אוטומטית. כדי להתגבר על מגבלות אלה ולאפשר שימוש בביוסנסורים מבוססי FRET עם פלואורופורים מרובים, פיתחנו גישות דימות וניתוח FRET היפרספקטרליות המספקות ספציפיות ספקטרלית לחישוב יעילות FRET והיכולת להפריד באופן ספקטי אותות FRET מפלואורסצנטיות אוטומטית מבלבלת ו / או אותות מתוויות פלואורסצנטיות נוספות. כאן, אנו מציגים את המתודולוגיה ליישום הדמיית FRET היפרספקטרלית, כמו גם את הצורך לבנות ספרייה ספקטרלית מתאימה כי הוא לא undersampled ולא דגימת יתר לבצע unmixing ספקטרלי. בעוד אנו מציגים מתודולוגיה זו למדידה של התפלגות טמפ תלת מימדית בתאי אנדותל מיקרו-וסקולריים ריאתיים (PMVECs), מתודולוגיה זו יכולה לשמש לחקר הפצות מרחביות של המחנה במגוון סוגי תאים.
Introduction
אדנוסין מונופוספט מחזורי (באנגלית: Adenosine monophosphate) הוא שליח שני המעורב בתהליכים תאיים ופיזיולוגיים מרכזיים, לרבות חלוקת תאים, זרם סידן, שעתוק גנים והתמרת אותות. גוףגדל והולך של ראיות מצביע על קיומם של תאי המחנה בתא שדרכו מושגת הספציפיות של האיתות 1,2,3,4,5,6,7. עד לאחרונה, מידור המחנה הסיק בהתבסס על השפעות פיזיולוגיות או תאיות ברורות הנגרמות על ידי אגוניסטים קולטנים שונים מצמידי G8,9,10,11. לאחרונה, בדיקות הדמיית פלואורסצנטיות מבוססות FRET סיפקו גישות חדשות למדידה ותצפית ישירה של אותות המחנה בתא12,13,14.
העברת אנרגיית תהודה של Förster (FRET) היא תופעה פיזית שבה העברת אנרגיה מתרחשת בין מולקולות תורם ומקבל בצורה לא רדיאטורית כאשר המולקולות נמצאות בסמיכות15,16. עם התפתחותם של אינדיקטורים פלואורסצנטיים מבוססי FRET, תופעה פיזית זו שימשה ביישומים ביולוגיים לחקר אינטראקציות חלבון-חלבון17, חלבון שיתוף לוקליזציה18, Ca+2 איתות19, ביטויגנים 20, חלוקת תאים21 ואיתות נוקלאוטיד מחזורי. מחווני המחנה מבוסס FRET מורכבים בדרך כלל מתחום כריכת המחנה, פלואורופור תורם ופלואורופור מקובל22. לדוגמה, חיישן H188 cAMP12,22 המשמש במתודולוגיה זו מורכב מתחום כריכת המחנה המתקבל מ- Epac, בין פלואורופורים בצבע טורקיז (תורם) ונוס (מקבל). בתנאים בסיסיים (לא מאוגדים), טורקיז ונוגה נמצאים באוריינטציה כך FRET מתרחשת בין הפלורופורים. בעת קשירת המחנה לתחום הכריכה, מתרחש שינוי קונפורמציה כך שטורקיז ונוגה מתרחקים זה מזה וכתוצאה מכך ירידה ב- FRET.
גישות הדמיה מבוססות FRET מציעות כלי מבטיח לחקירה והדמיה של אותות המחנה בתוך התא. עם זאת, טכניקות הדמיה מיקרוסקופיות מבוססות FRET הנוכחיות מצליחות לעתים קרובות רק באופן חלקי בהשגת עוצמת אות מספקת כדי למדוד FRET בבהירות מרחבית תת-תאית. זאת בשל מספר גורמים, כולל עוצמת האות המוגבלת של כתבי FRET רבים, רמת הדיוק הגבוהה הנדרשת לכימות מדויק של שינויים ביעילות FRET, ונוכחות של גורמים מבלבלים, כגון autofluorescence הסלולר23,24. התוצאה היא לעתים קרובות תמונה FRET כי הוא מוטרד על ידי SNR חלש, מה שהופך את הדמיה של שינויים תת תאיים FRET קשה מאוד. בנוסף, חקירה של אותות המחנה המותאמים לשפות הפליא בוצעה כמעט אך ורק בשני ממדים מרחביים בלבד והתפלגות המחנה צירי נחשבה לעתים רחוקות25. סביר להניח שהסיבה לכך היא ש-SNR נמוך עכב את היכולת למדוד ולדמיין מעברי צבע של המחנה בשלושה ממדים מרחביים. כדי להתגבר על מגבלות של שימוש בחיישני FRET עם SNR נמוך, יישמנו גישות הדמיה וניתוח היפרספקטרליות כדי למדוד FRET בתאים בודדים25,26,27.
גישות הדמיה היפרספקטרליות פותחו על ידי נאס”א כדי להבדיל בין אובייקטים יבשתיים הנמצאים בתמונותלווין 28,29. טכניקות אלה תורגמו מאז לשדה מיקרוסקופיה פלואורסצנטית30, עם מספר מערכות מיקרוסקופ קונפוקליות מסחריות המציעות גלאים ספקטרליים. בהדמיית פלואורסצנטיות מסורתית (לא ספקטרלית), המדגם מתרגש באמצעות מסנן פסים או קו לייזר, והפליטה נאספה באמצעות מסנן פסים שני, שנבחר לעתים קרובות כדי להתאים את אורך הגל של פליטת השיא של הפלואורופור(ים). לעומת זאת, גישות הדמיה היפרספקטרליות מבקשות לדגום פרופיל ספקטרלי מלא של פליטת פלואורסצנטיות26,31,32 או עירור33,34 במרווחי זמן ספציפיים אורך גל. במחקרים הקודמים שלנו, הראינו כי גישות הדמיה וניתוח היפרספקטרליות יכולות להציע כימות משופר של אותות FRET בתאים בהשוואה לטכניקות הדמיה FRET מבוססות מסנן מסורתיות26. כאן, אנו מציגים מתודולוגיה לביצוע חלוקות וניתוח FRET תלת-ממדיות (x, Y, z ו- λ) כדי למדוד ולדמיין התפלגותamp בשלושה ממדים מרחביים. גישות אלה אפשרו הדמיה של מעברי צבע מרחביים של cAMP הנגרמים על-ידי אגוניסט בתאים בודדים25. מעניין, בהתאם אגוניסט, מעברי צבע המחנה עשוי להיות גלוי בתאים. המתודולוגיה המוצגת כאן משתמשת בהסרת ההסרה הספקטרלית של רקע לא אחיד ואוטלואורסצנטיות תאית כדי לשפר את הדיוק של מדידות FRET. בעוד מתודולוגיה זו מודגמת בתאי אנדותל מיקרו וסקולריים ריאתיים (PMVECs) באמצעות biosensor FRET cAMP, המתודולוגיה יכולה בקלות להיות שונה לשימוש עם כתבי FRET חלופיים או קווי תאים חלופיים.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפיתוח של BIOSENSors FRET אפשר מדידה והדמיה של אותות נוקלאוטיד מחזורי בתאים בודדים, ויש הבטחה גדולה לדמיין אירועי איתות תת תאיים13,22,37,38. עם זאת, השימוש בביו-סנסורים FRET מציג מספר מגבלות, כולל מאפייני אות לרעש נמוכים של כתבי FRET מב…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצים להכיר ד”ר קס Jalink (המכון לסרטן הולנד ומרכז ואן Leeuwenhoek למיקרוסקופיה מתקדמת, אמסטרדם, הולנד) על כך שסיפק לנו את H188 cAMP FRET biosensor וקני טרינה (המכללה להנדסה, אוניברסיטת דרום אלבמה) על עזרה טכנית בהפחתת הזמן שנדרש כדי להפעיל את תסריטי התכנות המפותחים בהתאמה אישית שלנו.
המחברים רוצים להכיר במקורות המימון: איגוד הלב האמריקאי (16PRE27130004), הקרן הלאומית למדע; (1725937) NIH, S100D020149, S10RR027535, R01HL058506, P01HL066299).
Materials
| Attofluor Cell Chamber | Invitrogen | A7816 | Attofluor contains steel cell chambers and a rubber O-ring. Cell chamber holds the coverslip and O-ring provides a lock in mechanism to hold the buffer in cell chamber with out leakage |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | BP231-100 | Solvent used to prepare stock solution forskolin. |
| DRAQ5 Fluoroscent Probe Solution | Thermo Scientific | 62252 | Nuclear label |
| Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11965-092 | Contains nutrients and growth factors for the cells to grow and divide in the culture dishes. |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F6178 | Growth factor suppliment that is added to culture medium, DMEM |
| Forskolin | Sigma | F3917 | Adenyly cyclase activator. |
| H188 Cyclic AMP FRET biosensor | Netherland Cancer Institute, Dr. K. Jalink | Gift | Plasmid encoding Turquoise (donor fluorophore), Venus (acceptor fluorophore), and binding domain obtained from Epac. |
| Image J | image.net | Free download | Another image processing platform used to extact spectral information and image processing. |
| Integrating Sphere | Ocean Optics | FOIS-1 | Used to measure illumination intensity of the laser line at different laser intensities (?). |
| Laminin Mouse Protein, Natural | Invitrogen | 23017-015 | Coverslips are coated with laminin and this helps in cell attachment, growth and motility of the cell. |
| Lipofectamine 3000 Transfection Kit | Invitrogen | L3000-015 | Transfection reagent used to transfect cells with H188 FRET biosensor |
| MATLAB | Mathworks | R2019a | Image processing operations (linear unmixing and FRET efficiency calculations) are performed by writing custom programs in MATLAB programming environment |
| Nikon A1R confocal microscope | Nikon Instruments | Nikon A1R | Spectral image acquisition is performed using confocal microscope. |
| Nikon Elements Software | Nikon Instruments | Software dongle | used to export and handle nd2 image files (multidimensional image files) that are aquired using Nikon A1R |
| NIST-Traceable Calibration Lamp | Ocean Optics | LS-1-CAL-INT | A lamp with a known spectrum for use as a standard |
| PBS pH 7.4 (1X) | Gibco | 10010-023 | coomonly used buffer suring cell culture |
| Pulmonary Microvascular Endothelial Cells (PMVECs) | In house – Cell culture core, Univeristy of South Alabama | Isolated from Rat pulmonary microvasculature | PMVECs form inner lining of a blood vessel. |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Gibco | 15140-122 | antibiotics are added to culture medum to prevent contamination of the cells. |
| Pre-Cleaned Gold Seal Micro Slides | Clay Adams | 3010 | Microscope slides used for cell fixation |
| ProLong Diamond Antifade Mounting Media | Invitrogen | P36961 | If samples are fixed using antifade mountant, then the later protects fluoroscent dyes and chromophores from fading. |
| Spectrometer | Ocean Optics | QE65000 | Used to measure spectral response of the light source (?) |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200-056 | Digests the protein-protein bond between the cell and cell matrix and helps to disscociate and lift the cells during cell plating. |
| Tyrodes Buffer | Made in-house | Made in-house | Tyrodes buffer is used to make working solutions and to maintain cells in aqueous solution during image acquisition. |
| 6 Well Cell Culture Plate | Corning | 3506 | Laminin coated coverslips are placed in 6-well culture dish (one coverlisps/well). Cells along with medium is added into each well. |
| 25 mm Round Microscope Cover Slips | Fisher Scientific | 12545102 | Cells were grown on round glass coverslips |
| 60X Ojective | Nikon Instruments | Plan Apo VC 60X/1.2 WI ∞/0.15-0.18 WD 0.27 | water immersion and commonly used objective for cells |
References
- Corbin, J. D., Sugden, P. H., Lincoln, T. M., Keely, S. L. Compartmentalization of adenosine 3′:5′-monophosphate and adenosine 3′:5′-monophosphate-dependent protein kinase in heart tissue. The Journal of Biological Chemistry. 252, 3854-3861 (1977).
- Terrin, A., et al. PGE1 stimulation of HEK293 cells generates multiple contiguous domains with different [cAMP]: role of compartmentalized phosphodiesterases. The Journal of Cell Biology. 175, 441-451 (2006).
- Bacskai, B. J., et al. Spatially resolved dynamics of cAMP and protein kinase A subunits in Aplysia sensory neurons. Science. 260, 222-226 (1993).
- Iancu, R. V., Ramamurthy, G., Harvey, R. D. Spatial and temporal aspects of cAMP signalling in cardiac myocytes. Clinical and Experimental Pharmacology & Physiology. 35, 1343-1348 (2008).
- Brunton, L. L., Hayes, J. S., Mayer, S. E. Functional compartmentation of cyclic AMP and protein kinase in heart. Advances in Cyclic Nucleotide Research. 14, 391-397 (1981).
- Hohl, C. M., Li, Q. Compartmentation of cAMP in adult canine ventricular myocytes. Relation to single-cell free Ca2+ transients. Circulation Research. 69, 1369-1379 (1991).
- Rich, T. C., et al. A uniform extracellular stimulus triggers distinct cAMP signals in different compartments of a simple cell. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 13049-13054 (2001).
- Sayner, S. L., Alexeyev, M., Dessauer, C. W., Stevens, T. Soluble adenylyl cyclase reveals the significance of cAMP compartmentation on pulmonary microvascular endothelial cell barrier. Circulation Research. 98, 675-681 (2006).
- Rich, T. C., Tse, T. E., Rohan, J. G., Schaack, J., Karpen, J. W. In vivo assessment of local phosphodiesterase activity using tailored cyclic nucleotide-gated channels as cAMP sensors. The Journal of General Physiology. 118, 63-78 (2001).
- Blackman, B. E., et al. PDE4D and PDE4B function in distinct subcellular compartments in mouse embryonic fibroblasts. Journal of Biological Chemistry. 286, 12590-12601 (2011).
- Sayner, S. L., et al. Paradoxical cAMP-induced lung endothelial hyperpermeability revealed by Pseudomonas aeruginosa ExoY. Circulation Research. 95, 196-203 (2004).
- Klarenbeek, J., Jalink, K. Detecting cAMP with an EPAC-based FRET sensor in single living cells. Methods in Molecular Biology. 1071, 49-58 (2014).
- Surdo, N. C., et al. FRET biosensor uncovers cAMP nano-domains at β-adrenergic targets that dictate precise tuning of cardiac contractility. Nature Communications. 8, 15031 (2017).
- Ponsioen, B., et al. Detecting cAMP-induced Epac activation by fluorescence resonance energy transfer: Epac as a novel cAMP indicator. EMBO Reports. 5, 1176-1180 (2004).
- Vogel, S. S., Thaler, C., Koushik, S. V. Fanciful FRET. Science’s STKE. 2006, (2006).
- Clegg, R. M. The History of FRET: From conception through the labors of birth. Reviews in Fluorescence. 3, (2006).
- Giepmans, B. N. G., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. The fluorescent toolbox for assessing protein location and function. Science. 312, 217-224 (2006).
- Manzella-Lapeira, J., Brzostowski, J. A. Imaging protein-protein interactions by Förster resonance energy transfer (FRET) microscopy in live cells. Current Protocols in Protein Science. 93, 58 (2018).
- Cooper, D. M. F., Mons, N., Karpen, J. W. Adenylyl cyclases and the interaction between calcium and cAMP signalling. Nature. 374, 421-424 (1995).
- Sassone-Corsi, P. Coupling gene expression to cAMP signalling: role of CREB and CREM. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 30, 27-38 (1998).
- Rebhun, L. I. Cyclic nucleotides, calcium, and cell division. International Review of Cytology. 49, 1-54 (1977).
- Klarenbeek, J., Goedhart, J., Van Batenburg, A., Groenewald, D., Jalink, K. Fourth-generation Epac-based FRET sensors for cAMP feature exceptional brightness, photostability and dynamic range: characterization of dedicated sensors for FLIM, for ratiometry and with high affinity. PLOS ONE. 10, 0122513 (2015).
- Leavesley, S. J., Rich, T. C. FRET: signals hidden within the noise. Cytometry Part A. 85, 918-920 (2014).
- Rich, T. C., Webb, K. J., Leavesley, S. J. Can we decipher the information content contained within cyclic nucleotide signals. The Journal of General Physiology. 143, 17-27 (2014).
- Annamdevula, N. S., et al. Spectral imaging of FRET-based sensors reveals sustained cAMP gradients in three spatial dimensions. Cytometry Part A. 93 (10), 1029-1038 (2018).
- Leavesley, S. J., Britain, A. L., Cichon, L. K., Nikolaev, V. O., Rich, T. C. Assessing FRET using spectral techniques. Cytometry Part A. 83, 898-912 (2013).
- Leavesley, S. J., Rich, T. C. Overcoming limitations of FRET measurements. Cytometry Part A. 89, 325-327 (2016).
- Fink, D. J. Monitoring Earcths Resources from Space. Technology Review. 75, 32-41 (1973).
- Goetz, A. F. H., Vane, G., Solomon, J. E., Rock, B. N. Imaging Spectrometry for Earth Remote Sensing. Science. 228, 1147-1153 (1985).
- Bücherl, C. A., Bader, A., Westphal, A. H., Laptenok, S. P., Borst, J. W. FRET-FLIM applications in plant systems. Protoplasma. 251, 383-394 (2014).
- Chen, Y., Mauldin, J. P., Day, R. N., Periasamy, A. Characterization of spectral FRET imaging microscopy for monitoring nuclear protein interactions. Journal of Microscopy. 228, 139-152 (2007).
- Zimmermann, T., Rietdorf, J., Girod, A., Georget, V., Pepperkok, R. Spectral imaging and linear un-mixing enables improved FRET efficiency with a novel GFP2-YFP FRET pair. FEBS Letters. 531, 245-249 (2002).
- Griswold, J. R., Annamdevula, N., Deal, J., Rich, T., Leavesley, S. Estimating FRET Efficiency using Excitation-Scanning Hyperspectral Imaging. Biophysical Journal. 112, 586 (2017).
- Favreau, P. F., et al. Excitation-scanning hyperspectral imaging microscope. Journal of Biomedical Optics. 19, 046010 (2014).
- King, J., et al. Structural and functional characteristics of lung macro- and microvascular endothelial cell phenotypes. Microvascular Research. 67, 139-151 (2004).
- Thaler, C., Koushik, S. V., Blank, P. S., Vogel, S. S. Quantitative multiphoton spectral imaging and its use for measuring resonance energy transfer. Biophysical Journal. 89, 2736-2749 (2005).
- Agarwal, S. R., et al. Compartmentalized cAMP signaling associated with lipid raft and non-raft membrane domains in adult ventricular myocytes. Frontiers in Pharmacology. 9, 332 (2018).
- Johnstone, T. B., Agarwal, S. R., Harvey, R. D., Ostrom, R. S. cAMP signaling compartmentation: Adenylyl cyclases as anchors of dynamic signaling complexes. Mol Pharmacol. , (2017).
- Zhang, J., Li, H., Chai, L., Zhang, L., Qu, J., Chen, T. Quantitative FRET measurement using emission-spectral unmixing with independent excitation crosstalk correction. Journal of Microscopy. 257, 104-116 (2015).
- Zhang, J., Lin, F., Chai, L., Wei, L., Chen, T. IIem-spFRET: improved Iem-spFRET method for robust FRET measurement. Journal of Biomedical Optics. 21, 105003 (2016).
- Levy, S., et al. SpRET: highly sensitive and reliable spectral measurement of absolute FRET efficiency. Microscopy and Microanalysis. 17, 176-190 (2011).
- West, S. J., et al. Hyperspectral Measurements Allow Separation of FRET Signals from Non-Uniform Background Fluorescence. Biophysical Journal. 112, 453 (2017).
- Annamdevula, N. S., et al. An approach for characterizing and comparing hyperspectral microscopy systems. Sensors. 13, 9267-9293 (2013).
