Messung von 3-dimensionalen cAMP-Verteilungen in lebenden Zellen mittels 4-dimensionaler (x, y, z und λ) hyperspektraler FRET-Bildgebung und -Analyse
Summary
Aufgrund des inhärenten niedrigen Signal-Rausch-Verhältnisses (SNR) von Fӧrster-Resonanz-Energieübertragungssensoren (FRET) war die Messung von cAMP-Signalen eine Herausforderung, insbesondere in drei räumlichen Dimensionen. Hier beschreiben wir eine hyperspektrale FRET-Bildgebungs- und Analysemethodik, die die Messung der cAMP-Verteilung in drei räumlichen Dimensionen ermöglicht.
Abstract
Cyclic AMP ist ein zweiter Botenstoff, der an einer Vielzahl von zellulären und physiologischen Aktivitäten beteiligt ist. Mehrere Studien deuten darauf hin, dass cAMP-Signale kompartimentiert sind und dass die Kompartimentierung zur Signalspezifität innerhalb des cAMP-Signalwegs beiträgt. Die Entwicklung von FRET-basierten Biosensoren (Fӧrster resonance energy transfer) hat die Fähigkeit zur Messung und Visualisierung von cAMP-Signalen in Zellen gefördert. Diese Messungen beschränken sich jedoch oft auf zwei räumliche Dimensionen, was zu Fehlinterpretationen von Daten führen kann. Bisher gab es nur sehr begrenzte Messungen von cAMP-Signalen in drei räumlichen Dimensionen (x, y und z), aufgrund der technischen Einschränkungen bei der Verwendung von FRET-Sensoren, die von Natur aus ein niedriges Signal-Rausch-Verhältnis (SNR) aufweisen. Darüber hinaus sind herkömmliche filterbasierte Bildgebungsansätze aufgrund einer Reihe von Faktoren, einschließlich spektralem Übersprechen, begrenzter Signalstärke und Autofluoreszenz, oft unwirksam für die genaue Messung von cAMP-Signalsignalen in lokalisierten subzellulären Regionen. Um diese Einschränkungen zu überwinden und die Verwendung von FRET-basierten Biosensoren mit mehreren Fluorophoren zu ermöglichen, haben wir hyperspektrale FRET-Bildgebungs- und Analyseansätze entwickelt, die spektrale Spezifität für die Berechnung von FRET-Wirkungsgraden und die Fähigkeit bieten, FRET-Signale spektral von verwirrender Autofluoreszenz und / oder Signalen von zusätzlichen fluoreszierenden Markierungen zu trennen. Hier stellen wir die Methodik zur Implementierung der hyperspektralen FRET-Bildgebung sowie die Notwendigkeit vor, eine geeignete Spektralbibliothek zu konstruieren, die weder unter- noch übersampelt ist, um eine spektrale Entmischung durchzuführen. Während wir diese Methodik zur Messung dreidimensionaler cAMP-Verteilungen in pulmonalen mikrovaskulären Endothelzellen (PMVECs) vorstellen, könnte diese Methodik verwendet werden, um räumliche Verteilungen von cAMP in einer Reihe von Zelltypen zu untersuchen.
Introduction
Cyclisches Adenosinmonophosphat (cAMP) ist ein zweiter Botenstoff, der an wichtigen zellulären und physiologischen Prozessen wie Zellteilung, Kalziumzufluss, Gentranskription und Signaltransduktion beteiligt ist. Eine wachsende Zahl von Beweisen deutet auf die Existenz von cAMP-Kompartimenten in der Zelle hin, durch die die Signalspezifität erreicht wird1,2,3,4,5,6,7. Bis vor kurzem wurde die cAMP-Kompartimentierung auf der Grundlage verschiedener physiologischer oder zellulärer Effekte abgeleitet, die von verschiedenen G-gekoppelten Rezeptoragonisten induziert wurden8,9,10,11. In jüngerer Zeit haben FRET-basierte Fluoreszenzbildgebungssonden neue Ansätze für die direkte Messung und Beobachtung von cAMP-Signalen in einer Zelle12,13,14geliefert.
Förster-Resonanz-Energietransfer (FRET) ist ein physikalisches Phänomen, bei dem die Energieübertragung zwischen Donor- und Akzeptormolekülen in einer nicht-strahlenden Weise stattfindet, wenn sich die Moleküle in unmittelbarer Nähebefinden 15,16. Mit der Entwicklung von FRET-basierten Fluoreszenzindikatoren wurde dieses physikalische Phänomen in biologischen Anwendungen verwendet, um Protein-Protein-Interaktionen17, Protein-Co-Lokalisation18, Ca+2-Signalisierung 19, Genexpression20, Zellteilung21 und zyklische Nukleotidsignalisierung zu untersuchen. FRET-basierte cAMP-Indikatoren bestehen typischerweise aus einer cAMP-Bindungsdomäne, einem Donorfluorophor und einem Akzeptorfluorophor22. Zum Beispiel besteht der H188 cAMP-Sensor12,22, der in dieser Methodik verwendet wird, aus einer cAMP-Bindungsdomäne, die aus Epac gewonnen wird und zwischen Türkis- (Spender-) und Venus- (Akzeptor) Fluorophoren liegt. Bei basalen Bedingungen (ungebunden) sind Türkis und Venus in einer Ausrichtung, so dass FRET zwischen den Fluorophoren auftritt. Bei der Bindung von cAMP an die Bindungsdomäne tritt eine Konformationsänderung auf, so dass sich Türkis und Venus auseinander bewegen, was zu einer Abnahme der FRET führt.
FRET-basierte Bildgebungsansätze bieten ein vielversprechendes Werkzeug zur Untersuchung und Visualisierung von cAMP-Signalen innerhalb einer Zelle. Aktuelle FRET-basierte mikroskopische Bildgebungsverfahren sind jedoch oft nur teilweise erfolgreich, um eine ausreichende Signalstärke zu erreichen, um FRET mit subzellulärer räumlicher Klarheit zu messen. Dies ist auf mehrere Faktoren zurückzuführen, darunter die begrenzte Signalstärke vieler FRET-Reporter, die hohe Präzision, die erforderlich ist, um Änderungen der FRET-Effizienz genau zu quantifizieren, und das Vorhandensein von Störfaktoren wie zellulärer Autofluoreszenz23,24. Das Ergebnis ist oft ein FRET-Bild, das von schwachem SNR geplagt wird, was die Visualisierung subzellulärer Veränderungen in FRET sehr schwierig macht. Darüber hinaus wurde die Untersuchung von räumlich lokalisierten cAMP-Signalen fast ausschließlich in nur zwei räumlichen Dimensionen durchgeführt und die axiale cAMP-Verteilung wurde selten berücksichtigt25. Dies liegt wahrscheinlich daran, dass ein niedriger SNR die Fähigkeit behinderte, cAMP-Gradienten in drei räumlichen Dimensionen zu messen und zu visualisieren. Um die Einschränkungen bei der Verwendung von FRET-Sensoren mit niedrigem SNR zu überwinden, haben wir hyperspektrale Bildgebungs- und Analyseansätze zur Messung von FRET in einzelnen Zellen25,26,27implementiert.
Hyperspektrale Bildgebungsansätze wurden von der NASA entwickelt, um terrestrische Objekte in Satellitenbildern zu unterscheiden28,29. Diese Techniken wurden seitdem in das Fluoreszenzmikroskopiefeld30übersetzt, wobei mehrere kommerzielle konfokale Mikroskopsysteme Spektraldetektoren anbieten. Bei der traditionellen (nicht-spektralen) Fluoreszenzbildgebung wird die Probe mit einem Bandpassfilter oder einer Laserlinie angeregt, und die Emission wird mit einem zweiten Bandpassfilter gesammelt, der oft so ausgewählt wird, dass er der Maximalen Emissionswellenlänge des Fluorophors entspricht. Im Gegensatz dazu versuchen hyperspektrale Bildgebungsansätze, ein vollständiges spektrales Profil entweder der Fluoreszenzemission26,31,32 oder der Anregung 33,34in bestimmten Wellenlängenintervallen zu testen. In unseren früheren Studien haben wir gezeigt, dass hyperspektrale Bildgebungs- und Analyseansätze im Vergleich zu herkömmlichen filterbasierten FRET-Bildgebungsverfahren eine verbesserte Quantifizierung von FRET-Signalen in Zellen bieten können26. Hier stellen wir eine Methodik zur Durchführung von 4-dimensionalen (x, y, z und λ) hyperspektralen FRET-Bildgebung und -Analyse vor, um cAMP-Verteilungen in drei räumlichen Dimensionen zu messen und zu visualisieren. Diese Ansätze haben die Visualisierung von agonisteninduzierten cAMP-Raumgradienten in einzelnen Zellenermöglicht 25. Interessanterweise können je nach Agonist cAMP-Gradienten in Zellen sichtbar sein. Die hier vorgestellte Methodik nutzt die spektrale Entmischung von ungleichmäßigem Hintergrund und zellulärer Autofluoreszenz, um die Genauigkeit der FRET-Messungen zu verbessern. Während diese Methodik in pulmonalen mikrovaskulären Endothelzellen (PMVECs) mit einem cAMP FRET-Biosensor demonstriert wird, könnte die Methodik leicht für die Verwendung mit alternativen FRET-Reportern oder alternativen Zelllinien modifiziert werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Entwicklung von FRET-Biosensoren hat die Messung und Visualisierung von zyklischen Nukleotidsignalen in einzelnen Zellen ermöglicht, und es gibt große Vielversprechende für die Visualisierung subzellulärer Signalereignisse13,22,37,38. Die Verwendung von FRET-Biosensoren birgt jedoch mehrere Einschränkungen, darunter die niedrigen Signal-Rausch-Eigenschaften vieler fluoreszierender prot…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Dr. Kees Jalink (The Netherlands Cancer Institute und van Leeuwenhoek Center for Advanced Microscopy, Amsterdam, Niederlande) für die Bereitstellung des H188 cAMP FRET Biosensors und Kenny Trinh (College of Engineering, University of South Alabama) für die technische Hilfe bei der Reduzierung der Zeit, die für die Ausführung unserer speziell entwickelten Programmierskripte erforderlich ist.
Die Autoren möchten die Finanzierungsquellen anerkennen: American Heart Association (16PRE27130004), National Science Foundation; (1725937) NIH, S100D020149, S10RR027535, R01HL058506, P01HL066299).
Materials
| Attofluor Cell Chamber | Invitrogen | A7816 | Attofluor contains steel cell chambers and a rubber O-ring. Cell chamber holds the coverslip and O-ring provides a lock in mechanism to hold the buffer in cell chamber with out leakage |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | BP231-100 | Solvent used to prepare stock solution forskolin. |
| DRAQ5 Fluoroscent Probe Solution | Thermo Scientific | 62252 | Nuclear label |
| Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11965-092 | Contains nutrients and growth factors for the cells to grow and divide in the culture dishes. |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F6178 | Growth factor suppliment that is added to culture medium, DMEM |
| Forskolin | Sigma | F3917 | Adenyly cyclase activator. |
| H188 Cyclic AMP FRET biosensor | Netherland Cancer Institute, Dr. K. Jalink | Gift | Plasmid encoding Turquoise (donor fluorophore), Venus (acceptor fluorophore), and binding domain obtained from Epac. |
| Image J | image.net | Free download | Another image processing platform used to extact spectral information and image processing. |
| Integrating Sphere | Ocean Optics | FOIS-1 | Used to measure illumination intensity of the laser line at different laser intensities (?). |
| Laminin Mouse Protein, Natural | Invitrogen | 23017-015 | Coverslips are coated with laminin and this helps in cell attachment, growth and motility of the cell. |
| Lipofectamine 3000 Transfection Kit | Invitrogen | L3000-015 | Transfection reagent used to transfect cells with H188 FRET biosensor |
| MATLAB | Mathworks | R2019a | Image processing operations (linear unmixing and FRET efficiency calculations) are performed by writing custom programs in MATLAB programming environment |
| Nikon A1R confocal microscope | Nikon Instruments | Nikon A1R | Spectral image acquisition is performed using confocal microscope. |
| Nikon Elements Software | Nikon Instruments | Software dongle | used to export and handle nd2 image files (multidimensional image files) that are aquired using Nikon A1R |
| NIST-Traceable Calibration Lamp | Ocean Optics | LS-1-CAL-INT | A lamp with a known spectrum for use as a standard |
| PBS pH 7.4 (1X) | Gibco | 10010-023 | coomonly used buffer suring cell culture |
| Pulmonary Microvascular Endothelial Cells (PMVECs) | In house – Cell culture core, Univeristy of South Alabama | Isolated from Rat pulmonary microvasculature | PMVECs form inner lining of a blood vessel. |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Gibco | 15140-122 | antibiotics are added to culture medum to prevent contamination of the cells. |
| Pre-Cleaned Gold Seal Micro Slides | Clay Adams | 3010 | Microscope slides used for cell fixation |
| ProLong Diamond Antifade Mounting Media | Invitrogen | P36961 | If samples are fixed using antifade mountant, then the later protects fluoroscent dyes and chromophores from fading. |
| Spectrometer | Ocean Optics | QE65000 | Used to measure spectral response of the light source (?) |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200-056 | Digests the protein-protein bond between the cell and cell matrix and helps to disscociate and lift the cells during cell plating. |
| Tyrodes Buffer | Made in-house | Made in-house | Tyrodes buffer is used to make working solutions and to maintain cells in aqueous solution during image acquisition. |
| 6 Well Cell Culture Plate | Corning | 3506 | Laminin coated coverslips are placed in 6-well culture dish (one coverlisps/well). Cells along with medium is added into each well. |
| 25 mm Round Microscope Cover Slips | Fisher Scientific | 12545102 | Cells were grown on round glass coverslips |
| 60X Ojective | Nikon Instruments | Plan Apo VC 60X/1.2 WI ∞/0.15-0.18 WD 0.27 | water immersion and commonly used objective for cells |
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