Mesure des distributions cAMP à 3 dimensions dans des cellules vivantes à l’aide de l’imagerie et de l’analyse FRET hyperspectrales en 4 dimensions (x, y, z et λ)
Summary
En raison du faible rapport signal/bruit (SNR) inhérent aux capteurs basés sur le transfert d’énergie par résonance Fӧrster (FRET), la mesure des signaux cAMP a été difficile, en particulier dans trois dimensions spatiales. Nous décrivons ici une méthodologie d’imagerie et d’analyse FRET hyperspectrale qui permet de mesurer la distribution de l’AMPc en trois dimensions spatiales.
Abstract
L’AMP cyclique est un deuxième messager impliqué dans un large éventail d’activités cellulaires et physiologiques. Plusieurs études suggèrent que les signaux cAMP sont compartimentés et que le compartimentation contribue à la spécificité de la signalisation dans la voie de signalisation cAMP. Le développement de biocapteurs basés sur le transfert d’énergie par résonance de Fӧrster (FRET) a renforcé la capacité de mesurer et de visualiser les signaux cAMP dans les cellules. Cependant, ces mesures sont souvent limitées à deux dimensions spatiales, ce qui peut entraîner une mauvaise interprétation des données. À ce jour, il n’y a eu que des mesures très limitées des signaux cAMP dans trois dimensions spatiales (x, y et z), en raison des limitations techniques liées à l’utilisation des capteurs FRET qui présentent intrinsèquement un faible rapport signal/bruit (SNR). En outre, les approches traditionnelles d’imagerie par filtre sont souvent inefficaces pour mesurer avec précision les signaux cAMP dans les régions subcellulaires localisées en raison d’une gamme de facteurs, notamment la diaphonie spectrale, la force limitée du signal et l’autofluorescence. Pour surmonter ces limites et permettre aux biocapteurs à base de FRET d’être utilisés avec plusieurs fluorophores, nous avons développé des approches d’imagerie et d’analyse FRET hyperspectrales qui fournissent une spécificité spectrale pour le calcul des efficacités FRET et la capacité de séparer spectralement les signaux FRET de l’autofluorescence confondante et / ou des signaux d’étiquettes fluorescentes supplémentaires. Nous présentons ici la méthodologie de mise en œuvre de l’imagerie FRET hyperspectrale ainsi que la nécessité de construire une bibliothèque spectrale appropriée qui n’est ni sous-échantillonnée ni suréchantillonnée pour effectuer un démélange spectral. Bien que nous présentions cette méthodologie pour la mesure des distributions tridimensionnelles de l’AMPc dans les cellules endothéliales microvasculaires pulmonaires (PMVEC), cette méthodologie pourrait être utilisée pour étudier les distributions spatiales de l’AMPc dans une gamme de types de cellules.
Introduction
L’adénosine monophosphate cyclique (AMPc) est un deuxième messager impliqué dans les processus cellulaires et physiologiques clés, notamment la division cellulaire, l’afflux de calcium, la transcription des gènes et la transduction du signal. Un nombre croissant de preuves suggère l’existence de compartiments cAMP dans la cellule à travers lesquels la spécificité de signalisation est atteinte1,2,3,4,5,6,7. Jusqu’à récemment, la compartimentation de l’AMPc était déduite sur la base d’effets physiologiques ou cellulaires distincts induits par différents agonistes des récepteurs couplés G8,9,10,11. Plus récemment, les sondes d’imagerie de fluorescence basées sur FRET ont fourni de nouvelles approches pour la mesure et l’observation directes des signaux cAMP dans une cellule12,13,14.
Le transfert d’énergie par résonance de Förster (FRET) est un phénomène physique dans lequel le transfert d’énergie se produit entre les molécules donneuses et acceptrices de manière non radiative lorsque les molécules sont à proximité15,16. Avec le développement d’indicateurs fluorescents basés sur FRET, ce phénomène physique a été utilisé dans des applications biologiques pour étudier les interactions protéine-protéine17,la colocalisationprotéique 18,la signalisation Ca+2 19,l’expressiongénique 20,la division cellulaire21 et la signalisation nucléotidique cyclique. Les indicateurs cAMP basés sur FRET se composent généralement d’un domaine de liaison cAMP, d’un fluorophore donneur et d’un fluorophore accepteur22. Par exemple, le capteur H188 cAMP12,22 utilisé dans cette méthodologie consiste en un domaine de liaison cAMP obtenu à partir d’Epac, pris en sandwich entre les fluorophores Turquoise (donneur) et Vénus (accepteur). Dans des conditions basales (non liées), la Turquoise et Vénus sont dans une orientation telle que fret se produit entre les fluorophores. Lors de la liaison de l’AMPc au domaine de liaison, un changement conformationnel se produit de sorte que turquoise et Vénus se séparent, ce qui entraîne une diminution de FRET.
Les approches d’imagerie basées sur FRET offrent un outil prometteur pour étudier et visualiser les signaux cAMP au sein d’une cellule. Cependant, les techniques actuelles d’imagerie microscopique basées sur FRET ne réussissent souvent que partiellement à obtenir une force de signal suffisante pour mesurer FRET avec une clarté spatiale subcellulaire. Cela est dû à plusieurs facteurs, notamment la force limitée du signal de nombreux rapporteurs FRET, le haut niveau de précision requis pour quantifier avec précision les changements dans l’efficacité FRET et la présence de facteurs de confusion, tels que l’autofluorescence cellulaire23,24. Le résultat est souvent une image FRET qui est en proie à un faible SNR, ce qui rend la visualisation des changements subcellulaires dans FRET très difficile. En outre, l’étude des signaux cAMP localisés dans l’espace a été presque exclusivement effectuée dans seulement deux dimensions spatiales et la distribution axiale cAMP a rarement été considérée comme25. Cela est probablement dû au fait qu’un faible SNR a entravé la capacité de mesurer et de visualiser les gradients de l’AMPc dans trois dimensions spatiales. Pour surmonter les limites de l’utilisation de capteurs FRET à faible SNR, nous avons mis en œuvre des approches d’imagerie et d’analyse hyperspectrales pour mesurer FRET dans des cellules individuelles25,26,27.
Des approches d’imagerie hyperspectrale ont été développées par la NASA pour différencier les objets terrestres présents dans les images satellites28,29. Ces techniques ont depuis été traduites dans le domaine de la microscopie à fluorescence30,avec plusieurs systèmes de microscope confocal commerciaux offrant des détecteurs spectraux. Dans l’imagerie de fluorescence traditionnelle (non spectrale), l’échantillon est excité à l’aide d’un filtre passe-bande ou d’une ligne laser, et l’émission est collectée à l’aide d’un deuxième filtre passe-bande, souvent sélectionné pour correspondre à la longueur d’onde d’émission maximale du ou des fluorophores. En revanche, les approches d’imagerie hyperspectrale cherchent à échantillonner un profil spectral complet de l’émission de fluorescence26,31,32ou de l’excitation33 ,34à des intervalles de longueur d’onde spécifiques. Dans nos études précédentes, nous avons montré que les approches d’imagerie et d’analyse hyperspectrales peuvent offrir une meilleure quantification des signaux FRET dans les cellules par rapport aux techniques traditionnelles d’imagerie FRET basées sur desfiltres 26. Nous présentons ici une méthodologie pour effectuer une imagerie et une analyse FRET hyperspectrales en 4 dimensions (x, y, z et λ) afin de mesurer et de visualiser les distributions cAMP en trois dimensions spatiales. Ces approches ont permis de visualiser les gradients spatiaux de l’AMPc induits par les agonistes dans des cellules individuelles25. Fait intéressant, selon l’agoniste, des gradients d’AMPc peuvent être apparents dans les cellules. La méthodologie présentée ici utilise le démélange spectral du fond non uniforme et de l’autofluorescence cellulaire pour améliorer la précision des mesures FRET. Bien que cette méthodologie soit démontrée dans les cellules endothéliales microvasculaires pulmonaires (PMVEC) à l’aide d’un biocapteur FRET cAMP, la méthodologie pourrait facilement être modifiée pour être utilisée avec d’autres rapporteurs FRET ou des lignées cellulaires alternatives.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le développement des biocapteurs FRET a permis la mesure et la visualisation des signaux nucléotidiques cycliques dans des cellules individuelles, et il existe de grandes promesses pour visualiser les événements de signalisation subcellulaire13,22,37,38. Cependant, l’utilisation de biocapteurs FRET présente plusieurs limites, notamment les faibles caractéristiques signal-bruit de nombre…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier le Dr Kees Jalink (Institut néerlandais du cancer et centre van Leeuwenhoek pour la microscopie avancée, Amsterdam, Pays-Bas) pour nous avoir fourni le biocapteur H188 cAMP FRET et Kenny Trinh (College of Engineering, Université de South Alabama) pour leur aide technique afin de réduire le temps nécessaire à l’exécution de nos scripts de programmation développés sur mesure.
Les auteurs tiennent à remercier les sources de financement suivantes : American Heart Association (16PRE27130004), National Science Foundation; (1725937) NIH, S100D020149, S10RR027535, R01HL058506, P01HL066299).
Materials
| Attofluor Cell Chamber | Invitrogen | A7816 | Attofluor contains steel cell chambers and a rubber O-ring. Cell chamber holds the coverslip and O-ring provides a lock in mechanism to hold the buffer in cell chamber with out leakage |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | BP231-100 | Solvent used to prepare stock solution forskolin. |
| DRAQ5 Fluoroscent Probe Solution | Thermo Scientific | 62252 | Nuclear label |
| Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11965-092 | Contains nutrients and growth factors for the cells to grow and divide in the culture dishes. |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F6178 | Growth factor suppliment that is added to culture medium, DMEM |
| Forskolin | Sigma | F3917 | Adenyly cyclase activator. |
| H188 Cyclic AMP FRET biosensor | Netherland Cancer Institute, Dr. K. Jalink | Gift | Plasmid encoding Turquoise (donor fluorophore), Venus (acceptor fluorophore), and binding domain obtained from Epac. |
| Image J | image.net | Free download | Another image processing platform used to extact spectral information and image processing. |
| Integrating Sphere | Ocean Optics | FOIS-1 | Used to measure illumination intensity of the laser line at different laser intensities (?). |
| Laminin Mouse Protein, Natural | Invitrogen | 23017-015 | Coverslips are coated with laminin and this helps in cell attachment, growth and motility of the cell. |
| Lipofectamine 3000 Transfection Kit | Invitrogen | L3000-015 | Transfection reagent used to transfect cells with H188 FRET biosensor |
| MATLAB | Mathworks | R2019a | Image processing operations (linear unmixing and FRET efficiency calculations) are performed by writing custom programs in MATLAB programming environment |
| Nikon A1R confocal microscope | Nikon Instruments | Nikon A1R | Spectral image acquisition is performed using confocal microscope. |
| Nikon Elements Software | Nikon Instruments | Software dongle | used to export and handle nd2 image files (multidimensional image files) that are aquired using Nikon A1R |
| NIST-Traceable Calibration Lamp | Ocean Optics | LS-1-CAL-INT | A lamp with a known spectrum for use as a standard |
| PBS pH 7.4 (1X) | Gibco | 10010-023 | coomonly used buffer suring cell culture |
| Pulmonary Microvascular Endothelial Cells (PMVECs) | In house – Cell culture core, Univeristy of South Alabama | Isolated from Rat pulmonary microvasculature | PMVECs form inner lining of a blood vessel. |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Gibco | 15140-122 | antibiotics are added to culture medum to prevent contamination of the cells. |
| Pre-Cleaned Gold Seal Micro Slides | Clay Adams | 3010 | Microscope slides used for cell fixation |
| ProLong Diamond Antifade Mounting Media | Invitrogen | P36961 | If samples are fixed using antifade mountant, then the later protects fluoroscent dyes and chromophores from fading. |
| Spectrometer | Ocean Optics | QE65000 | Used to measure spectral response of the light source (?) |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200-056 | Digests the protein-protein bond between the cell and cell matrix and helps to disscociate and lift the cells during cell plating. |
| Tyrodes Buffer | Made in-house | Made in-house | Tyrodes buffer is used to make working solutions and to maintain cells in aqueous solution during image acquisition. |
| 6 Well Cell Culture Plate | Corning | 3506 | Laminin coated coverslips are placed in 6-well culture dish (one coverlisps/well). Cells along with medium is added into each well. |
| 25 mm Round Microscope Cover Slips | Fisher Scientific | 12545102 | Cells were grown on round glass coverslips |
| 60X Ojective | Nikon Instruments | Plan Apo VC 60X/1.2 WI ∞/0.15-0.18 WD 0.27 | water immersion and commonly used objective for cells |
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