Productie van IgG Fusion Proteins transiently uitgedrukt in Nicotiana benthamiana
Summary
We beschrijven hier een eenvoudige methode voor expressie, extractie en zuivering van recombinant menselijke IgG versmolten tot GFP in Nicotiana benthamiana. Dit protocol kan worden uitgebreid tot zuivering en visualisatie van tal van eiwitten die kolomchromatografie gebruiken. Bovendien is het protocol aanpasbaar aan het persoonlijke en virtuele college onderwijs laboratorium, het verstrekken van project-based exploratie.
Abstract
De grote vraag naar antilichamen als therapeutische interventies voor verschillende infectieuze, metabole, auto-immuun-, neoplastische en andere ziekten creëert een groeiende behoefte aan het ontwikkelen van efficiënte methoden voor recombinante antilichaamproductie. Vanaf 2019 waren er meer dan 70 door de FDA goedgekeurde monoklonale antilichamen en is er een exponentieel groeipotentieel. Ondanks hun belofte, beperkende factoren voor wijdverbreid gebruik zijn productiekosten en complexiteit. Mogelijk bieden fabrieken goedkope, veilige en gemakkelijk schaalbare eiwitproductiestrategieën. Planten zoals Nicotiana benthamiana kunnen niet alleen complexe zoogdiereiwitten correct vouwen en assembleren, maar kunnen ook kritische post-translationele wijzigingen toevoegen die vergelijkbaar zijn met die van celculturen van zoogdieren. In dit werk, met behulp van native GFP en een zuur-stabiele variant van groene fluorescerende eiwitten (GFP) versmolten met menselijke monoklonale antilichamen, waren we in staat om de gehele voorbijgaande antilichaam expressie en zuivering proces van N. benthamiana planten visualiseren. Afhankelijk van het doel van het experiment kan native GFP-fusie zorgen voor een eenvoudigere visualisatie tijdens de expressiefase in de planten, terwijl zuur-stabiele GFP-fusie visualisatie mogelijk maakt tijdens downstreamverwerking. Deze schaalbare en eenvoudige procedure kan worden uitgevoerd door een enkele onderzoeker om milligram hoeveelheden zeer zuivere antilichaam of antilichaam fusie eiwitten te produceren in een kwestie van dagen met behulp van slechts een paar kleine planten. Een dergelijke techniek kan worden uitgebreid tot de visualisatie van elk type antilichaam zuiveringsproces en mogelijk vele andere eiwitten, zowel in plantaardige als andere expressiesystemen. Bovendien kunnen deze technieken profiteren van virtuele instructies en worden uitgevoerd in een academisch laboratorium door undergraduate studenten met minimale eerdere ervaring met moleculaire biologie technieken, het verstrekken van een basis voor project-based exploratie met real-world toepassingen.
Introduction
Industrie rapporten geven aan dat dertien van de twintig meest brutowinst drugs in de Verenigde Staten waren biologische (eiwit-gebaseerde geneesmiddelen), waarvan negen waren antilichamen. Vanaf 2019 waren er meer dan 570 antilichaam (Ab) therapieën in verschillende klinische ontwikkelingsfasen1,2,3. De huidige wereldwijde ab-omzet bedraagt meer dan 100 miljard USD en de monoklonale ab (mAb) therapeutische markt zal naar verwachting tot 300 miljard USD genereren in 20251,4. Met zo’n hoge vraag en verwachte stijgingen van de inkomsten, onderzoekers hebben gewerkt aan manieren om Ab therapeutics te produceren op een steeds grotere schaal, met een hogere kwaliteit en lagere kosten te ontwikkelen. Plantaardige expressiesystemen hebben verschillende voordelen ten opzichte van traditionele zoogdiercellijnen voor de betaalbare en grootschalige productie van Ab therapeutics5,6. Voor de productie van eiwittherapeutisch in planten (“moleculair pharming”) zijn geen dure bioreactoren of celkweekfaciliteiten nodig, net als traditionele zoogdiercelkweektechnieken7,8. Planten kunnen geen menselijke ziekteverwekkers oplopen, waardoor potentiële besmetting tot een minimalisering wordtgeminimaliseerd 9. Zowel voorbijgaande als transgene plantaardige eiwitexpressie kan worden gebruikt als goedkopere alternatieven voor zoogdier- of bacteriële productiesystemen10. Hoewel transgene planten de voorkeur hebben voor de productie van gewassen, kan recombinante eiwitproductie met behulp van deze methode weken tot maanden duren. Vooruitgang in tijdelijke expressie met behulp van virale vectoren door middel van spuit of vacuüm agroinfiltratie zorgen voor een kleine en grootschalige productie, respectievelijk, van het gewenste eiwit in de dagen11,12,13,14. De productie van mAbs tegen ebola, Dengue en Zika, en tal van andere recombinante eiwitten, zijn snel en efficiënt geproduceerd en gezuiverd met behulp van tijdelijke expressie in N. benthamiana planten15,16,17,18,19. Deze omstandigheden maken tijdelijke plantaardige expressie een aantrekkelijke optie voor het ontwikkelen van meerdere Ab therapeutica en de methoden die in dit protocol20 wordenaangetoond .
MAb’s van de eerste generatie waren van murineafscheiding, wat resulteerde in niet-specifieke immunogeniciteit bij gebruik in menselijke proeven21. Na verloop van tijd, chimeric, gehumaniseerd, en uiteindelijk, volledig menselijke Abs werden geproduceerd om immunogeniciteit veroorzaakt door Ab therapeutica te verminderen. Helaas veroorzaken sommige van deze Abs nog steeds gastheer immunogeniciteit als gevolg van verschillen in glycosylation21. Ontwikkelingen in de installatietechniek hebben gezorgd voor de wijziging van Ab glycans, wat essentieel is omdat de stabiliteit en functie van een Ab aanzienlijk kunnen worden beïnvloed door zijn glycosylation staat22. De vooruitgang heeft de productie in plantaardige systemen van hoog-niveauuitdrukking van gehumaniseerde mAbs mogelijk gemaakt, die menselijke glycanen en resulterend de gewenste biologische eigenschappen van een massa-geproduceerde menselijk farmaceutisch19,21bevatten .
Naast recombinant Abs, Ab fusie moleculen (Ab fusies) zijn onderzocht voor verschillende doeleinden in de afgelopen decennia. Ab fusies bestaan vaak uit een Ab of Ab fragment gefuseerd tot een molecuul of eiwit en zijn ontworpen om reacties uit te lokken van immuun effector cellen23. Deze moleculen zijn gemaakt als potentiële therapeutische interventies voor de behandeling van verschillende pathologieën zoals kanker en auto-immuunziekten24,25,26,27. Recombinant immune complexs (RICs) zijn een andere klasse van Ab fusies die zijn gebruikt als vaccin kandidaten28. RICs maken gebruik van het vermogen van het immuunsysteem om de Fc-regio’s van Ab-fusies te herkennen en blijken de immunogeniciteit te verbeteren in combinatie met andere vaccinplatforms29,30,31.
Green Fluorescent Protein (GFP) is een bioluminescent eiwit afkomstig van de kwal Aequorea Victoria, die groen licht uitzendt wanneer opgewonden door ultraviolet licht32,33. In de loop der jaren is het gebruik van GFP als visuele marker van genexpressie uitgebreid van expressie in Escherichia coli tot tal van eiwitexpressiesystemen, waaronder N. benthamiana-planten 34,35,36,37,38. Zichtbare markers, zoals GFP, hebben overvloedige implicaties in het onderwijzen en leren van wetenschappelijke concepten. Tal van instapstudenten beschrijven moeilijkheden bij het begrijpen van wetenschappelijke concepten wanneer het idee dat wordt onderwezen niet met het blote oog zichtbaar is, zoals de concepten van moleculaire biologie en aanverwante gebieden39. Visuele markers, zoals GFP, kunnen zo bijdragen aan de verwerking van informatie met betrekking tot de wetenschappelijke processen en kunnen helpen de moeilijkheden te verminderen die studenten rapporteren bij het leren van tal van wetenschappelijke concepten.
Hoewel GFP vaak wordt gebruikt als een marker om gen en expressie in vivoaan te geven, is het moeilijk om het te visualiseren in de downstream processen bij het gebruik van zure omstandigheden. Deze omstandigheid is voornamelijk omdat GFP zijn structuur en resulterende fluorescentie niet behoudt bij een lage pH40. Tijdelijke zure omgevingen zijn vaak nodig in verschillende zuiveringsprocessen, zoals eiwit G, eiwit A, en eiwit L chromatografie, vaak gebruikt voor Ab zuivering41,42,43,44. GFP-mutanten zijn gebruikt om fluorescentie onder zure omstandigheden45,46te behouden .
Hierin beschrijven we een eenvoudige methode voor expressie, extractie en zuivering van recombinante IgG fusie-eiwitten in N. benthamiana planten. We produceerden traditionele GFP gefuseerd naar de N-terminus van een gehumaniseerde IgG zware keten, het creëren van een GFP-IgG fusie. Tegelijkertijd ontwikkelden we de fusie van een plant codon-geoptimaliseerde sequentie voor een zuur-stabiele GFP (asGFP) naar de N-terminus van een gehumaniseerde IgG zware keten, het creëren van een asGFP-IgG fusie. De voordelen van het produceren van GFP-IgG omvatten de mogelijkheid om de aanwezigheid van een doeleiwit tijdens expressie te visualiseren, terwijl asGFP-IgG het mogelijk maakt om de aanwezigheid van recombinant eiwit te zien in niet alleen de expressie- en extractiestappen, maar ook in de zuiveringsstappen van het eiwit. Dit protocol kan worden aangepast voor de productie, zuivering en visualisatie van een reeks GFP-fusie-eiwitten geproduceerd in N. benthamiana en gezuiverd met behulp van chromatografietechnieken die een lage pH vereisen. Het proces kan ook worden afgestemd op verschillende hoeveelheden bladmateriaal. Terwijl Abs en fusie-eiwitten gelabeld met GFP of asGFP zijn niet bedoeld om te worden gebruikt voor therapieën, deze methoden kunnen nuttig zijn als controles tijdens experimenten en kan ook verder worden gebruikt als een leermiddel voor moleculaire en cellulaire biologie en biotechnologie, zowel in-persoon en vrijwel.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol kan worden gebruikt voor de visuele verificatie van alle recombinant Ab of recombinant eiwit geproduceerd in N. benthamiana planten, met inbegrip van die vereisen tijdelijke blootstelling aan zure omgevingen voor kolom zuivering doeleinden42,43,44. Bovendien kan de fusie van asGFP naar andere eiwitten in verschillende expressiesystemen een nuttig hulpmiddel zijn voor experimentele visualisatie en onderwijs….
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Maria Pia DiPalma voor het bewerken van de video. We danken ook het Office of Educational Outreach and Student Services aan de Arizona State University voor hun genereuze publicatie vergoeding bijstand. Onderzoek voor dit protocol werd ondersteund door de School of Life Sciences, Arizona State University.
Materials
| 5 mL syringe | any | N/A | |
| 50 mL syringe | any | N/A | |
| Agar | SIGMA-ALDRICH | A5306 | |
| Blender with cups | any | N/A | |
| Bromophenol blue | Bio-Rad | 1610404 | |
| DTT (DL-Dithiothreitol) | MP BIOMEDICALS | 219482101 | |
| EDTA (Ethylenedinitrilo)tetraacetic acid | SIGMA-ALDRICH | E-6760 | |
| Ethanol | any | N/A | |
| Glycerol | G-Biosciences | BTNM-0037 | |
| Glycine | SIGMA-ALDRICH | G7126-500G | |
| HCl (Hydrochloric acid) | EMD MILLIPORE CORPORATION | HX0603-4 | |
| Heating block | any reputable supplier | N/A | |
| Jiffy-7 727 w/hole peat pellets | Hummert International | 14237000 | |
| Kanamycin | Gold Biotechnology Inc | K-120-100 | |
| KCl (Potassium Chloride) | SIGMA-ALDRICH | P9541-500G | |
| KH2PO4 (Potassium Phosphate) | J.t.baker | 3248-05 | |
| KOH (Potassium Hydroxide) | VWR | BDH0262 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | SIGMA-ALDRICH | M2773 | |
| MES (2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid) | SIGMA-ALDRICH | M8250 | |
| Miracloth | Millipore | 4 75855-1R | |
| Moisture control potting mix | Miracle-Gro | 755783 | |
| Na2HPO4 (Sodium Phosphate) | J.t.baker | 3827-01 | |
| NaCl (Sodium Chloride) | Santa Cruz Biotechnology | sc-203274C | |
| Nicotiana benthamiana seeds | any reputable supplier | N/A | |
| PMSF (Phenylmethylsulfonyl Fluoride) | G-Biosciences | 786-787 | |
| Polypropylene Column | any | N/A | |
| Precision Plus Protein Dual Color Standards | Bio-Rad | 1610394 | |
| Protein G resin | Thermo Fisher Scientific | 20399 | |
| Rifampicin | Gold Biotechnology Inc | R-120-25 | |
| SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) | G-Biosciences | DG093 | |
| Sodium Ascorbate | SIGMA-ALDRICH | A7631-500G | |
| Spectrophotometer | any reputable supplier | N/A | |
| Titan3 0.75 µm glass fiber filter | ThermoScientific | 40725-GM | |
| Tray for peat pellets with dome | any | N/A | |
| TRIS Base | J.t.baker | 4109-02 | |
| Tris-HCl | Amresco | M108-1KG | |
| Tryptone | SIGMA-ALDRICH | 17221 | |
| UV lamp | any | N/A | |
| Water Soluble All Purpose Plant Food | Miracle-Gro | 2000992 | |
| Yeast extract | SIGMA-ALDRICH | 9182 |
References
- Lu, R. M., et al. Development of therapeutic antibodies for the treatment of diseases. Journal of Biomedical Science. 27 (1), (2020).
- Kaplon, H., Reichert, J. M. Antibodies to watch in 2019. mAbs. 11 (2), 219-238 (2019).
- The top 20 drugs by U.S. sales. FiercePharma Available from: https://www.fiercepharma.com/special-report/top-20-drugs-by-2018-u-s-sales (2018)
- Grilo, A. L., Mantalaris, A. The Increasingly Human and Profitable Monoclonal Antibody Market. Trends in Biotechnology. 37 (1), 9-16 (2019).
- Kim, M. -. Y., et al. Novel vaccination approach for dengue infection based on recombinant immune complex universal platform. Vaccine. 33 (15), 1830-1838 (2015).
- Twyman, R. M., Schillberg, S., Fischer, R. Transgenic plants in the biopharmaceutical market. Expert Opinion on Emerging Drugs. 10 (1), 185-218 (2005).
- Stoger, E., Fischer, R., Moloney, M., Ma, J. K. -. C. Plant Molecular Pharming for the Treatment of Chronic and Infectious Diseases. Annual Review of Plant Biology. 65 (1), 743-768 (2014).
- Buyel, J. F., Fischer, R. Predictive models for transient protein expression in tobacco (Nicotiana tabacum L.) can optimize process time, yield, and downstream costs. Biotechnology and Bioengineering. 109 (10), 2575-2588 (2012).
- Yao, J., Weng, Y., Dickey, A., Wang, K. Y. Plants as factories for human pharmaceuticals: Applications and challenges. International Journal of Molecular Sciences. 16 (12), 28549-28565 (2015).
- Mor, T. S., Moon, Y. -. S., Palmer, K. E., Mason, H. S. Geminivirus vectors for high-level expression of foreign proteins in plant cells. Biotechnology and Bioengineering. 81 (4), 430-437 (2003).
- Hefferon, K. L. Plant virus expression vectors set the stage as production platforms for biopharmaceutical proteins. Virology. 433 (1), 1-6 (2012).
- Yamamoto, T., et al. Improvement of the transient expression system for production of recombinant proteins in plants. Scientific Reports. 8 (1), 4755 (2018).
- Zhong, G. Y., et al. Commercial production of aprotinin in transgenic maize seeds. Molecular Breeding. 5 (4), 345-356 (1999).
- Giddings, G., Allison, G., Brooks, D., Carter, A. Transgenic plants as factories for biopharmaceuticals. Nature Biotechnology. 18 (11), 1151-1155 (2000).
- Fulton, A., Lai, H., Chen, Q., Zhang, C. Purification of monoclonal antibody against Ebola GP1 protein expressed in Nicotiana benthamiana. Journal of Chromatography A. 1389, 128-132 (2015).
- Diamos, A., et al. A highly expressing, soluble, and stable plant-made IgG fusion carrying Zika virus envelope domain III elicits potent immunogenic responses in mice without adjuvant. Frontiers in immunology. 3140 (11), (2020).
- Hunter, J. G. L., et al. Evaluation of a toxoid fusion protein vaccine produced in plants to protect poultry against necrotic enteritis. PeerJ. 2019 (3), 6600 (2019).
- Dent, M., et al. Plant-produced anti-dengue virus monoclonal antibodies exhibit reduced antibody-dependent enhancement of infection activity. Journal of General Virology. 97 (12), 3280-3290 (2016).
- Diamos, A. G., et al. High Level Production of Monoclonal Antibodies Using an Optimized Plant Expression System. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 472 (2020).
- Olinger, G. G., et al. Delayed treatment of Ebola virus infection with plant-derived monoclonal antibodies provides protection in rhesus macaques. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (44), 18030-18035 (2012).
- Mastrangeli, R., Palinsky, W., Bierau, H. Glycoengineered antibodies: towards the next-generation of immunotherapeutics. Glycobiology. 29 (3), 199-210 (2019).
- Montero-Morales, L., Steinkellner, H. Advanced Plant-Based Glycan Engineering. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 81 (2018).
- Joosten, V., Lokman, C., vanden Hondel, C. A. M. J. J., Punt, P. J. The production of antibody fragments and antibody fusion proteins by yeasts and filamentous fungi. Microbial Cell Factories. 2 (1), 1-15 (2003).
- Müller, D. Antibody fusions with immunomodulatory proteins for cancer therapy. Pharmacology and Therapeutics. 154, 57-66 (2015).
- Bootz, F., Neri, D. Immunocytokines: A novel class of products for the treatment of chronic inflammation and autoimmune conditions. Drug Discovery Today. 21 (1), 180-189 (2016).
- Jafari, R., Zolbanin, N. M., Rafatpanah, H., Majidi, J., Kazemi, T. Fc-fusion Proteins in Therapy: An Updated View. Current Medicinal Chemistry. 24 (12), (2017).
- Brinkmann, U., Kontermann, R. E. The making of bispecific antibodies. mAbs. 9 (2), 182-212 (2017).
- Mason, H. S. Recombinant immune complexes as versatile and potent vaccines. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 12 (4), 988-989 (2016).
- Mason, H. S. Recombinant immune complexes as versatile and potent vaccines. Human Vaccines and Immunotherapeutics. 12 (4), 988-989 (2016).
- Diamos, A. G., et al. Vaccine synergy with virus-like particle and immune complex platforms for delivery of human papillomavirus L2 antigen. Vaccine. 37 (1), 137-144 (2019).
- Diamos, A. G., et al. Codelivery of improved immune complex and virus-like particle vaccines containing Zika virus envelope domain III synergistically enhances immunogenicity. Vaccine. 38 (18), 3455-3463 (2020).
- Prasher, D. C., Eckenrode, V. K., Ward, W. W., Prendergast, F. G., Cormier, M. J. Primary structure of the Aequorea victoria green-fluorescent protein. Gene. 111 (2), 229-233 (1992).
- Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
- Palm, M., Baumstark-Khan, C., Horneck, G. Green Fluorescent Protein (GFP) Expression in Mammalian Cells After UV-Irradiation. Fundamentals for the Assessment of Risks from Environmental Radiation. , 311-316 (1999).
- Paemeleire, K., et al. Intercellular calcium waves in HeLa cells expressing GFP-labeled connexin 43, 32, or 26. Molecular Biology of the Cell. 11 (5), 1815-1827 (2000).
- Harper, B. K., Stewart, C. N. Patterns of Green Fluorescent Protein Expression in Transgenic Plants. Plant Molecular Biology Reporter. 18 (2), 141 (2000).
- Kaishima, M., Ishii, J., Matsuno, T., Fukuda, N., Kondo, A. Expression of varied GFPs in Saccharomyces cerevisiae: Codon optimization yields stronger than expected expression and fluorescence intensity. Scientific Reports. 6, (2016).
- . Glow in the Dark: Fluorescent Proteins as Cell and Tissue-Specific Markers in Plants Available from: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/21772029/ (2020)
- Mnguni, L. E. The theoretical cognitive process of visualization for science education. SpringerPlus. 3 (1), 1-9 (2014).
- Shaner, N. C., Patterson, G. H., Davidson, M. W. Advances in fluorescent protein technology. Journal of Cell Science. 120 (24), 4247-4260 (2007).
- Bjorck, L., Kronvall, G. Purification and some properties of streptococcal protein G, a novel IgG-Binding reagent. The Journal of Immunology. 133 (2), (1984).
- Andrew, S. M., Titus, J. A. Purification of Immunoglobulin G. Current Protocols in Immunology. 21 (1), 1-12 (2001).
- Hober, S., Nord, K., Linhult, M. Protein A chromatography for antibody purification. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 848 (1), 40-47 (2007).
- Vola, R., Lombardi, A., Tarditi, L., Björck, L., Mariani, M. Recombinant proteins L and LG: efficient tools for purification of murine immunoglobulin G fragments. Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications. 668 (2), 209-218 (1995).
- Shinoda, H., Ma, Y., Nakashima, R., Sakurai, K., Matsuda, T., Nagai, T. Acid-Tolerant Monomeric GFP from Olindias formosa. Cell Chemical Biology. 25 (3), 330-338 (2018).
- Roberts, T. M., et al. Identification and Characterisation of a pH-stable GFP. Scientific Reports. 6 (1), 1-9 (2016).
- Brunelle, J. L., Green, R. Coomassie blue staining. Methods in Enzymology. 541, 161-167 (2014).
- Mahmood, T., Western Yang, P. C. Western blot: Technique, theory, and trouble shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4 (9), 429-434 (2012).
- Vessoni Penna, T. C., Ishii, M., Cholewa, O., de Souza, L. C. Thermal characteristics of recombinant green fluorescent protein (GFPuv) extracted from Escherichia coli. Letters in Applied Microbiology. 38 (2), 135-139 (2004).
- Kang, S. J., Park, E. A., Lee, D. H., Hong, K. W. Comparison of the stability of eGFP displayed on the Bacillus subtilis spore surface using CotB and C-terminally truncated CotB proteins as an anchoring motif under extreme conditions. Applied Biological Chemistry. 62 (1), 41 (2019).
- Kuta, D. D., Tripathi, L. Agrobacterium-induced hypersensitive necrotic reaction in plant cells: a resistance response against Agrobacterium-mediated DNA transfer. African Journal of Biotechnology. 4 (8), 752-757 (2005).
- Qiusheng, Z., Bao, J., Likun, L., Xianhua, X. Effects of antioxidants on the plant regeneration and GUS expressive frequency of peanut (Arachis hypogaea) explants by Agrobacterium tumefaciens. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 81 (1), 83-90 (2005).
- Diamos, A. G., Rosenthal, S. H., Mason, H. S. H.S. 5′ and 3′ Untranslated Regions Strongly Enhance Performance of Geminiviral Replicons in Nicotiana benthamiana Leaves. Frontiers in Plant Science. 7, 200 (2016).
- Huang, Z., Chen, Q., Hjelm, B., Arntzen, C., Mason, H. A DNA replicon system for rapid high-level production of virus-like particles in plants. Biotechnology and Bioengineering. 103 (4), 706-714 (2009).
- Diamos, A. G., Mason, H. S. Modifying the Replication of Geminiviral Vectors Reduces Cell Death and Enhances Expression of Biopharmaceutical Proteins in Nicotiana benthamiana Leaves. Frontiers in Plant Science. 9, 1974 (2019).
- Gordon-Kamm, W., et al. Stimulation of the cell cycle and maize transformation by disruption of the plant retinoblastoma pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (18), 11975-11980 (2002).
- Villemont, E., Dubois, F., Sangwan, R. S., Vasseur, G., Bourgeois, Y., Sangwan-Norreel, B. S. Role of the host cell cycle in the Agrobacterium-mediated genetic transformation of Petunia: Evidence of an S-phase control mechanism for T-DNA transfer. Planta. 201 (2), 160-172 (1997).
- Regnard, G. L., Halley-Stott, R. P., Tanzer, F. L., Hitzeroth, I. I., Rybicki, E. P. High level protein expression in plants through the use of a novel autonomously replicating geminivirus shuttle vector. Plant Biotechnology Journal. 8 (1), 38-46 (2010).
- Chen, Q., He, J., Phoolcharoen, W., Mason, H. S. Geminiviral vectors based on bean yellow dwarf virus for production of vaccine antigens and monoclonal antibodies in plants. Human Vaccines. 7 (3), 331-338 (2011).
- Morton, T. G., Gold, A. J., Sullivan, W. M. Influence of Overwatering and Fertilization on Nitrogen Losses from Home Lawns. Journal of Environmental Quality. 17 (1), 124-130 (1988).
- Brown, J. C. Iron Chlorosis in Plants. Advances in Agronomy. 13, 329-369 (1961).
- Morton, E. R., Fuqua, C. Laboratory Maintenance of Agrobacterium. Current Protocols in Microbiology. , (2012).
