निकोटियाना बेंथामियाना में आईजीजी फ्यूजन प्रोटीन का उत्पादन क्षणिक रूप से व्यक्त किया गया
Summary
हम यहां निकोटियाना बेंथामियानामें जीएफपी के लिए अभिव्यक्ति, निष्कर्षण और पुनर्संयोजन मानव आईजीजी की शुद्धि के लिए एक सरल विधि का वर्णन करते हैं। इस प्रोटोकॉल को कई प्रोटीन के शुद्धिकरण और दृश्यीकरण तक बढ़ाया जा सकता है जो कॉलम क्रोमेटोग्राफी का उपयोग करते हैं। इसके अलावा, प्रोटोकॉल में व्यक्ति और आभासी कॉलेज शिक्षण प्रयोगशाला के लिए अनुकूलनीय है, परियोजना आधारित अंवेषण प्रदान करते हैं ।
Abstract
विभिन्न संक्रामक, मेटाबोलिक, ऑटोइम्यून, नियोप्लास्टिक और अन्य बीमारियों के लिए चिकित्सीय हस्तक्षेप के रूप में एंटीबॉडी की उच्च मांग पुनः संयोजन एंटीबॉडी उत्पादन के लिए कुशल तरीकों को विकसित करने में बढ़ती आवश्यकता पैदा करती है। 2019 तक, 70 से अधिक एफडीए-अनुमोदित मोनोक्लोनल एंटीबॉडी थे, और घातीय विकास क्षमता है। अपने वादे के बावजूद, व्यापक उपयोग के लिए सीमित कारक विनिर्माण लागत और जटिलता हैं । संभावित रूप से, पौधे कम लागत, सुरक्षित और आसानी से स्केलेबल प्रोटीन विनिर्माण रणनीतियों की पेशकश करते हैं। निकोटियाना बेंथामियाना जैसे पौधे न केवल जटिल स्तनधारी प्रोटीन को सही ढंग से मोड़ और इकट्ठा कर सकते हैं बल्कि स्तनधारी कोशिका संस्कृतियों द्वारा पेश किए गए महत्वपूर्ण पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों को भी जोड़ सकते हैं। इस काम में, देशी जीएफपी और मानव मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के लिए जुड़े हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) के एसिड-स्थिर संस्करण का उपयोग करके, हम एन बेंथामियाना पौधों से पूरे क्षणिक एंटीबॉडी अभिव्यक्ति और शुद्धिकरण प्रक्रिया की कल्पना करने में सक्षम थे। प्रयोग के उद्देश्य के आधार पर, देशी जीएफपी संलयन पौधों में अभिव्यक्ति चरण के दौरान आसान दृश्य सुनिश्चित कर सकता है, जबकि एसिड-स्थिर जीएफपी संलयन डाउनस्ट्रीम प्रसंस्करण के दौरान दृश्य के लिए अनुमति देता है। यह स्केलेबल और सीधी प्रक्रिया केवल कुछ छोटे पौधों का उपयोग करके दिनों के मामले में अत्यधिक शुद्ध एंटीबॉडी या एंटीबॉडी फ्यूजन प्रोटीन की मिलीग्राम मात्रा का उत्पादन करने के लिए एक शोधकर्ता द्वारा की जा सकती है। इस तरह की तकनीक को पौधे और अन्य अभिव्यक्ति प्रणालियों दोनों में एंटीबॉडी शुद्धिकरण प्रक्रिया और संभावित रूप से कई अन्य प्रोटीन के दृश्य तक बढ़ाया जा सकता है। इसके अलावा, इन तकनीकों आभासी निर्देशों को लाभ और स्नातक आणविक जीव विज्ञान तकनीकों के साथ ंयूनतम पूर्व अनुभव रखने के छात्रों द्वारा एक शिक्षण प्रयोगशाला में मार डाला जा सकता है, वास्तविक दुनिया अनुप्रयोगों के साथ परियोजना आधारित अंवेषण के लिए एक नींव प्रदान करते हैं ।
Introduction
उद्योग की रिपोर्टों से संकेत मिलता है कि संयुक्त राज्य अमेरिका में बीस सबसे अधिक कमाई करने वाली दवाओं में से तेरह जीवविज्ञान (प्रोटीन आधारित फार्मास्यूटिकल्स) थे, जिनमें से नौ एंटीबॉडी थे । 2019 तक, विभिन्न नैदानिक विकास चरणों1,2,3में 570 से अधिक एंटीबॉडी (एबी) चिकित्सीय थे। वर्तमान वैश्विक एबी की बिक्री 100 बिलियन अमरीकी डॉलर से अधिक है, और मोनोक्लोनल एबी (एमएबी)चिकित्सीय बाजार 2025 तक1,4तक 300 बिलियन अमरीकी डॉलर तक उत्पन्न होने की उम्मीद है। इस तरह की उच्च मांग और राजस्व में अनुमानित वृद्धि के साथ, शोधकर्ताओं ने उच्च गुणवत्ता और कम लागत के साथ, एक कभी बड़े पैमाने पर एबी चिकित्सा विज्ञान का उत्पादन करने के तरीके विकसित करने के लिए काम कर रहा है । संयंत्र आधारित अभिव्यक्ति प्रणालियों के पास एबी थेराप्यूटिक्स5,6के किफायती और बड़े पैमाने पर निर्माण के लिए पारंपरिक स्तनधारी सेल लाइनों पर कई फायदे हैं। पौधों में प्रोटीन चिकित्सा विज्ञान के उत्पादन (“आणविक pharming”) को महंगी बायोरिएक्टर या सेल संस्कृति सुविधाओं की आवश्यकता नहीं होती है जैसा कि पारंपरिक स्तनधारी सेल संस्कृति तकनीक7,8है। पौधे मानव रोगजनकों को अनुबंधित नहीं कर सकते हैं, संभावित संदूषण को कम नहीं करसकते हैं 9। क्षणिक और ट्रांसजेनिक संयंत्र आधारित प्रोटीन अभिव्यक्ति दोनों का उपयोग स्तनधारी या जीवाणु उत्पादन प्रणालियों10के लिए कम लागत वाले विकल्प के रूप में किया जा सकता है । हालांकि ट्रांसजेनिक पौधों को फसल उत्पादन के लिए पसंद किया जाता है, लेकिन इस विधि का उपयोग करके पुनः संयोजन प्रोटीन उत्पादन के लिए हफ्तों से महीनों की आवश्यकता हो सकती है। 11,12, 13, 14दिनों में वांछित प्रोटीन के क्रमशः छोटे और बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए छोटे और बड़े पैमाने पर उत्पादन की अनुमति। इबोला, डेंगू और ज़िका और कई अन्य पुनः संयोजन प्रोटीन के खिलाफ एमएबी का उत्पादन एन बेंथामियाना संयंत्रों15, 16, 17,18,19में क्षणिक अभिव्यक्ति का उपयोग करके जल्दी और कुशलता से शुद्ध किया गया है। ये परिस्थितियां क्षणिक पौधे आधारित अभिव्यक्ति को कई एबी चिकित्सा विज्ञान और इस प्रोटोकॉल20में प्रदर्शित तरीकों को विकसित करने के लिए एक आकर्षक विकल्प बनाती हैं।
पहली पीढ़ी के mAbs मुरीन व्युत्पन्न के थे, जिसके परिणामस्वरूप मानव परीक्षणों में उपयोग किए जाने पर गैर-विशिष्ट इम्यूनोजेनिसिटी21हुई। समय के साथ, चिमरिक, मानवीकृत, और अंततः, एबी चिकित्सा विज्ञान द्वारा प्रेरित इम्यूनोजेनिकिटी को कम करने के लिए पूरी तरह से मानव एब्स का उत्पादन किया गया था। दुर्भाग्य से, इनमें से कुछ एब्स अभी भी ग्लाइकोसिलेशन21में अंतर के कारण मेजबान इम्यूनोजेनिकिटी का कारण बनते हैं। संयंत्र इंजीनियरिंग में विकास ने एबी ग्लाइकन के संशोधन के लिए अनुमति दी है, जो आवश्यक है क्योंकि एबी की स्थिरता और कार्य इसके ग्लाइकोसिलेशन राज्य22से काफी प्रभावित हो सकता है। अग्रिमों ने मानवीकृत एमएबी की उच्च स्तरीय अभिव्यक्ति की पौध प्रणालियों में उत्पादन की अनुमति दी है, जिसमें मानव ग्लाइकन होते हैं और परिणामस्वरूप बड़े पैमाने पर उत्पादित मानव दवा19,21के वांछित जैविक लक्षण होते हैं।
हाल के दशकों में विभिन्न उद्देश्यों के लिए पुनर्संयोजन एब्स के अलावा एबी फ्यूजन अणुओं (एबी फ्यूजन) का पता लगाया गया है । एबी फ्यूजन में अक्सर एक एबी या एबी टुकड़ा होता है जो अणु या प्रोटीन से जुड़ा होता है और प्रतिरक्षा प्रभावक कोशिकाओं से प्रतिक्रियाओं को प्राप्त करने के लिए डिज़ाइन किया जाता है23. इन अणुओं को कैंसर और ऑटोइम्यून रोगों24 , 25 , 26,27जैसी विभिन्न विकृतियों के इलाज के लिए संभावित चिकित्सीय हस्तक्षेपकेरूप मेंबनायागया है । Recombinant प्रतिरक्षा परिसरों (RICs) एबी संलयन का एक और वर्ग है कि टीका उंमीदवारों के रूप में नियोजित किया गया है28। आरआईसी एबी फ्यूजन के एफसी क्षेत्रों को पहचानने की प्रतिरक्षा प्रणाली की क्षमता का लाभ उठाते हैं और अन्यवैक्सीन प्लेटफार्मों29,30,31के साथ संयुक्त होने पर इम्यूनोजेनिसिटी में सुधार करने के लिए पाए गए हैं।
ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) जेलीफ़िश एक्वारिया विक्टोरिया से प्राप्त एक बायोल्यूमिनेसेंट प्रोटीन है, जो पराबैंगनी प्रकाश32,33से उत्साहित होने पर हरी रोशनी का उत्सर्जन करता है। इन वर्षों में, जीन अभिव्यक्ति के एक दृश्य मार्कर के रूप में जीएफपी का उपयोग एस्चेरिचिया कोलाई में अभिव्यक्ति से कई प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रणालियों तक विस्तारित हुआ है, जिसमें एन बेंथामियाना पौधे34,35,36,37,38शामिल हैं। जीएफपी जैसे दृश्यमान मार्कर, वैज्ञानिक अवधारणाओं के शिक्षण और सीखने में प्रचुर मात्रा में निहितार्थ हैं। कई प्रवेश स्तर के छात्रों को वैज्ञानिक अवधारणाओं लोभी कठिनाइयों का वर्णन जब विचार सिखाया जा रहा है नग्न आंखों को दिखाई नहीं है, जैसे आणविक जीव विज्ञान और संबंधित क्षेत्रों की अवधारणाओं के रूप में३९। जीएफपी जैसे दृश्य मार्कर, इस प्रकार वैज्ञानिक प्रक्रियाओं से संबंधित जानकारी के प्रसंस्करण में योगदान दे सकते हैं और कई वैज्ञानिक अवधारणाओं को सीखने में छात्रों की रिपोर्ट में कठिनाइयों को कम करने में मदद कर सकते हैं।
हालांकि जीएफपी का उपयोग अक्सर वीवो मेंजीन और अभिव्यक्ति को इंगित करने के लिए मार्कर के रूप में किया जाता है, लेकिन अम्लीय स्थितियों का उपयोग करने पर डाउनस्ट्रीम प्रक्रियाओं में इसकी कल्पना करना मुश्किल होता है। यह परिस्थिति मुख्य रूप से इसलिए है क्योंकि जीएफपी अपनी संरचना को बनाए नहीं रखता है और परिणामस्वरूप कम पीएच40पर फ्लोरेसेंस होता है। विभिन्न शुद्धिकरण प्रक्रियाओं में अस्थायी अम्लीय वातावरण की अक्सर आवश्यकता होती है, जैसे प्रोटीन जी, प्रोटीन ए, और प्रोटीन एल क्रोमेटोग्राफी, अक्सर एबी शुद्धि41, 42,43,44के लिए उपयोग कियाजाताहै। अम्लीय परिस्थितियों में फ्लोरेसेंस बनाए रखने के लिए जीएफपी म्यूटेंट का उपयोग किया गया है45,46.
इसके साथ ही हम एन बेंथामियाना पौधों में पुनर्संयोजन आईजीजी फ्यूजन प्रोटीन की अभिव्यक्ति, निष्कर्षण और शुद्धि के लिए एक सरल विधि का वर्णन करते हैं। हमने एक मानवीकृत आईजीजी भारी श्रृंखला के एन-टर्मिनस के लिए पारंपरिक जीएफपी का उत्पादन किया, जिससे जीएफपी-आईजीजी संलयन पैदा हुआ। इसके साथ ही, हमने एक मानवीकृत आईजीजी भारी श्रृंखला के एन-टर्मिनस के लिए एसिड-स्थिर जीएफपी (एएसजीएफपी) के लिए एक पौधे कोडन-अनुकूलित अनुक्रम का संलयन विकसित किया, जिससे एक एएसजीएफपी-आईजीजी संलयन बन गया। जीएफपी-आईजीजी के उत्पादन के फायदों में अभिव्यक्ति के दौरान लक्षित प्रोटीन की उपस्थिति की कल्पना करने की क्षमता शामिल है, जबकि एएसजीएफपी-आईजीजी न केवल अभिव्यक्ति और निष्कर्षण चरणों में बल्कि प्रोटीन के शुद्धिकरण चरणों में भी पुनः संयोजन प्रोटीन की उपस्थिति को देखने की अनुमति देता है। इस प्रोटोकॉल को एन बेंथामियाना में उत्पादित जीएफपी फ्यूजन प्रोटीन की एक श्रृंखला के उत्पादन, शुद्धिकरण और दृश्य के लिए अनुकूलित किया जा सकता है और क्रोमेटोग्राफी तकनीकों का उपयोग करके शुद्ध किया जा सकता है जिसके लिए कम पीएच की आवश्यकता होती है। इस प्रक्रिया को पत्ती सामग्री की विभिन्न मात्रा के अनुरूप भी किया जा सकता है। जबकि जीएफपी या एएसजीएफपी के साथ टैग किए गए एब्स और फ्यूजन प्रोटीन का उपयोग उपचारों के लिए नहीं किया जाता है, इन तरीकों को प्रयोगों के दौरान नियंत्रण के रूप में उपयोगी किया जा सकता है और इसे आणविक और सेलुलर जीव विज्ञान और जैव प्रौद्योगिकी के लिए एक शिक्षण उपकरण के रूप में आगे भी उपयोग किया जा सकता है, दोनों व्यक्ति और वस्तुतः।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल का उपयोग एन बेंथामियाना संयंत्रों में उत्पादित किसी भी पुनर्संयोजन एबी या पुनर्संयोजन प्रोटीन के दृश्य सत्यापन के लिए किया जा सकता है, जिसमें वे लोग शामिल हैं जिन्हें कॉलम शुद्धिकरण …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम वीडियो संपादन के लिए मारिया पिया DiPalma शुक्रिया अदा करते हैं । हम भी उनके उदार प्रकाशन शुल्क सहायता के लिए एरिजोना राज्य विश्वविद्यालय में शैक्षिक आउटरीच और छात्र सेवाओं के कार्यालय का शुक्रिया अदा करते हैं । इस प्रोटोकॉल के लिए अनुसंधान जीवन विज्ञान, एरिजोना राज्य विश्वविद्यालय के स्कूल द्वारा समर्थित किया गया था ।
Materials
| 5 mL syringe | any | N/A | |
| 50 mL syringe | any | N/A | |
| Agar | SIGMA-ALDRICH | A5306 | |
| Blender with cups | any | N/A | |
| Bromophenol blue | Bio-Rad | 1610404 | |
| DTT (DL-Dithiothreitol) | MP BIOMEDICALS | 219482101 | |
| EDTA (Ethylenedinitrilo)tetraacetic acid | SIGMA-ALDRICH | E-6760 | |
| Ethanol | any | N/A | |
| Glycerol | G-Biosciences | BTNM-0037 | |
| Glycine | SIGMA-ALDRICH | G7126-500G | |
| HCl (Hydrochloric acid) | EMD MILLIPORE CORPORATION | HX0603-4 | |
| Heating block | any reputable supplier | N/A | |
| Jiffy-7 727 w/hole peat pellets | Hummert International | 14237000 | |
| Kanamycin | Gold Biotechnology Inc | K-120-100 | |
| KCl (Potassium Chloride) | SIGMA-ALDRICH | P9541-500G | |
| KH2PO4 (Potassium Phosphate) | J.t.baker | 3248-05 | |
| KOH (Potassium Hydroxide) | VWR | BDH0262 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | SIGMA-ALDRICH | M2773 | |
| MES (2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid) | SIGMA-ALDRICH | M8250 | |
| Miracloth | Millipore | 4 75855-1R | |
| Moisture control potting mix | Miracle-Gro | 755783 | |
| Na2HPO4 (Sodium Phosphate) | J.t.baker | 3827-01 | |
| NaCl (Sodium Chloride) | Santa Cruz Biotechnology | sc-203274C | |
| Nicotiana benthamiana seeds | any reputable supplier | N/A | |
| PMSF (Phenylmethylsulfonyl Fluoride) | G-Biosciences | 786-787 | |
| Polypropylene Column | any | N/A | |
| Precision Plus Protein Dual Color Standards | Bio-Rad | 1610394 | |
| Protein G resin | Thermo Fisher Scientific | 20399 | |
| Rifampicin | Gold Biotechnology Inc | R-120-25 | |
| SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) | G-Biosciences | DG093 | |
| Sodium Ascorbate | SIGMA-ALDRICH | A7631-500G | |
| Spectrophotometer | any reputable supplier | N/A | |
| Titan3 0.75 µm glass fiber filter | ThermoScientific | 40725-GM | |
| Tray for peat pellets with dome | any | N/A | |
| TRIS Base | J.t.baker | 4109-02 | |
| Tris-HCl | Amresco | M108-1KG | |
| Tryptone | SIGMA-ALDRICH | 17221 | |
| UV lamp | any | N/A | |
| Water Soluble All Purpose Plant Food | Miracle-Gro | 2000992 | |
| Yeast extract | SIGMA-ALDRICH | 9182 |
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