Produksjon av IgG Fusion Proteiner Forbigående Uttrykt i Nicotiana benthamiana

Summary

Vi beskriver her en enkel metode for uttrykk, ekstraksjon og rensing av rekombinant human IgG smeltet til GFP i Nicotiana benthamiana. Denne protokollen kan utvides til rensing og visualisering av mange proteiner som benytter kolonnekromatografi. Videre er protokollen tilpasningsdyktig til personlig og virtuell høyskoleundervisningslaboratorium, som gir prosjektbasert utforskning.

Abstract

Høy etterspørsel etter antistoffer som terapeutiske intervensjoner for ulike smittsomme, metabolske, autoimmune, neoplastiske og andre sykdommer skaper et økende behov for å utvikle effektive metoder for rekombinant antistoffproduksjon. Per 2019 var det mer enn 70 FDA-godkjente monoklonale antistoffer, og det er eksponentielt vekstpotensial. Til tross for deres løfte, begrensende faktorer for utbredt bruk er produksjonskostnader og kompleksitet. Potensielt tilbyr planter rimelige, trygge og lett skalerbare proteinproduksjonsstrategier. Planter som Nicotiana benthamiana kan ikke bare riktig brette og montere komplekse pattedyrproteiner, men kan også legge til kritiske post-translasjonelle modifikasjoner som ligner på de som tilbys av pattedyrcellekulturer. I dette arbeidet, ved hjelp av innfødte GFP og en syre-stabil variant av grønt fluorescerende protein (GFP) smeltet til humane monoklonale antistoffer, var vi i stand til å visualisere hele forbigående antistoffuttrykk og rensingsprosess fra N. benthamiana planter. Avhengig av eksperimentets formål kan innfødt GFP-fusjon sikre enklere visualisering under uttrykksfasen i plantene, mens syrestabil GFP-fusjon gjør det mulig å visualisere under nedstrøms behandling. Denne skalerbare og enkle prosedyren kan utføres av en enkelt forsker for å produsere mg mengder svært rene antistoff- eller antistofffusjonsproteiner i løpet av få dager ved hjelp av bare noen få små planter. En slik teknikk kan utvides til visualisering av alle typer antistoffrensingsprosesser og potensielt mange andre proteiner, både i plante- og andre uttrykkssystemer. Videre kan disse teknikkene være til nytte for virtuelle instruksjoner og bli utført i et undervisningslaboratorium av lavere studenter som har minimal tidligere erfaring med molekylærbiologiteknikker, og gir grunnlag for prosjektbasert utforskning med virkelige applikasjoner.

Introduction

Bransjerapporter tyder på at tretten av de tjue mest innbringende stoffene i USA var biologiske (proteinbaserte legemidler), hvorav ni var antistoffer. Per 2019 var det over 570 antistoff (Ab) terapeutiske midler i ulike kliniske utviklingsfaser^1,2,3. Nåværende globale Ab salg overstiger 100 milliarder USD, og monoklonale Ab (mAb) terapeutiske markedet forventes å generere opp til 300 milliarder USD innen 2025^1,4. Med så høy etterspørsel og forventede økninger i inntektene, har forskere jobbet med å utvikle måter å produsere Ab-terapeutiske midler i en stadig større skala, med høyere kvalitet og lavere kostnader. Plantebaserte uttrykkssystemer har flere fordeler fremfor tradisjonelle pattedyrcellelinjer for rimelig og storskala produksjon av Ab therapeutics^5,6. Produksjon av proteinterapeutiske midler i planter (“molekylær pharming”) krever ikke dyre bioreaktorer eller cellekulturfasiliteter som tradisjonelle pattedyrcellekulturteknikker^7,8. Planter kan ikke kontrakt menneskelige patogener, minimere potensiell forurensning⁹. Både forbigående og transgent plantebasert proteinuttrykk kan benyttes som rimeligere alternativer til pattedyr- eller bakterieproduksjonssystemer¹⁰. Selv om transgene planter foretrekkes for avlingsproduksjon, kan rekombinant proteinproduksjon ved hjelp av denne metoden kreve uker til måneder. Fremskritt i forbigående uttrykk ved hjelp av virale vektorer gjennom enten sprøyte eller vakuum agroinfiltrasjon tillater henholdsvis små- og storskala produksjon av ønsket protein i dag^11,12,13,14. Produksjon av mAbs mot Ebola, Dengue og Zika, og mange andre rekombinante proteiner, har blitt produsert og renset raskt og effektivt ved hjelp av forbigående uttrykk i N. benthamiana ^{planter 15,16,17,18,19}. Disse omstendighetene gjør forbigående plantebasert uttrykk et attraktivt alternativ for å utvikle flere Ab-terapeutiske midler og metodene som er demonstrert i denne protokollen²⁰.

Førstegenerasjons mAbs var av murinavledning, noe som resulterte i ikke-spesifikk immunogenitet når de brukes i humane studier²¹. Over tid, chimeric, humanisert, og til slutt, fullt menneskelig Abs ble produsert for å redusere immunogenisitet indusert av Ab terapeutiske. Dessverre forårsaker noen av disse Abs fortsatt vertsimmunogenitet på grunn av forskjeller i glykosylering²¹. Utviklingen i anleggsteknikk har tillatt for modifisering av Ab glycans, noe som er viktig siden en Ab stabilitet og funksjon kan betydelig påvirkes av sin glykosylering tilstand²². Fremskritt har tillatt produksjon i plantesystemer av høyt nivå uttrykk for humaniserte mAbs, som inneholder menneskelige glykomaner og resulterende de ønskede biologiske egenskapene til en masseprodusert menneskelig farmasøytisk^19,21.

I tillegg til rekombinante Abs, ab fusjonmolekyler (Ab fusjoner) har blitt utforsket for ulike formål de siste tiårene. Ab fusjoner består ofte av en Ab eller Ab fragment smeltet til et molekyl eller protein og er utformet for å fremkalle svar fra immuneffektorceller²³. Disse molekylene har blitt opprettet som potensielle terapeutiske inngrep for å behandle ulike patologier som kreft og autoimmune^{sykdommer 24,25,26,27}. Rekombinante immunkomplekser (IC) er en annen klasse av Ab fusjoner som har blitt ansatt som vaksinekandidater²⁸. RICs dra nytte av immunsystemet evne til å gjenkjenne Fc regioner av Ab fusjoner og har blitt funnet å forbedre immunogenisitet når kombinert med andre vaksine plattformer^29,30,31.

Green Fluorescent Protein (GFP) er et bioluminescerende protein avledet fra manetene Aequorea Victoria, som avgir grønt lys når begeistret av ultrafiolett^{lys 32,33}. Gjennom årene har GFP bruk som en visuell markør for genuttrykk utvidet fra uttrykk i Escherichia coli til mange protein uttrykkssystemer, inkludert N. benthamiana ^{planter 34,35,36,37,38}. Synlige markører, som GFP, har rikelig implikasjoner i undervisning og læring av vitenskapelige begreper. Tallrike entry-level studenter beskriver vanskeligheter med å forstå vitenskapelige begreper når ideen blir undervist er ikke synlig for det blotte øye, for eksempel begrepene molekylærbiologi og relaterte felt³⁹. Visuelle markører, som GFP, kan dermed bidra til behandling av informasjon knyttet til de vitenskapelige prosessene og kan bidra til å redusere vanskelighetene studentene rapporterer i å lære mange vitenskapelige konsepter.

Selv om GFP ofte brukes som markør for å indikere gen og uttrykk in vivo, er det vanskelig å visualisere det i nedstrømsprosessene hvis du bruker sure forhold. Denne situasjonen er først og fremst fordi GFP ikke opprettholder sin struktur og resulterende fluorescens ved lav pH⁴⁰. Midlertidige sure miljøer er ofte nødvendig i ulike renseprosesser, for eksempel protein G, protein A og protein L kromatografi, ofte benyttet for Ab rensing^41,42,43,44. GFP mutanter har blitt brukt til å beholde fluorescens under sure^{forhold 45,46}.

Her beskriver vi en enkel metode for uttrykk, ekstraksjon og rensing av rekombinante IgG-fusjonsproteiner i N. benthamiana-planter. Vi produserte tradisjonell GFP smeltet til N-endestasjonen til en humanisert IgG tung kjede, og skapte en GFP-IgG-fusjon. Samtidig utviklet vi fusjonen av en plantekodonoptimalisert sekvens for en syrestabil GFP (asGFP) til N-endestasjonen til en humanisert IgG-tung kjede, noe som skaper en asGFP-IgG-fusjon. Fordelene ved å produsere GFP-IgG inkluderer evnen til å visualisere tilstedeværelsen av et målprotein under uttrykket, mens asGFP-IgG gjør det mulig å se tilstedeværelsen av rekombinant protein i ikke bare uttrykks- og ekstraksjonstrinnene, men også i proteinets rensetrinn. Denne protokollen kan tilpasses for produksjon, rensing og visualisering av en rekke GFP fusjonsproteiner produsert i N. benthamiana og renset ved hjelp av kromatografi teknikker som krever lav pH. Prosessen kan også skreddersys til ulike mengder bladmateriale. Mens Abs og fusjonsproteiner merket med GFP eller asGFP ikke er ment å brukes til terapi, kan disse metodene være nyttige som kontroller under eksperimenter og kan også videre benyttes som et undervisningsverktøy for molekylær og cellulær biologi og bioteknologi, både personlig og praktisk talt.

Protocol

1. Dyrke N. benthamiana planter Legg jord torvpellets på et brett og hell tidligere kokt, fortsatt varmt (~ 40-45 ° C), vann over torvpellets for full ekspansjon. Etter pellets er fullt utvidet, plasser 2-3 N. benthamiana frø på hver torv pellet ved hjelp av pinsett. Hell ca 0,5 i vann for å dekke bunnen av brettet. Merk skuffen med såingsdatoen. Fortsett å vanne plantene daglig med passende mengder gjødsel. Gjødsel (vannløselig all-purpose…

Representative Results

Denne studien viser en enkel og rask metode for å produsere rekombinante proteiner og visualisere dem gjennom nedstrøms prosesser. Ved hjelp av N. benthamiana og etter den medfølgende protokollen, kan rekombinant proteinproduksjon beskrevet her oppnås på mindre enn en uke. Den generelle arbeidsflyten for planteuttrykk, ekstraksjon og rensing vises i figur 1. Stadier av plantevekst fra 2-ukers gamle frøplanter, 4-ukers gamle planter og 6-ukers gamle planter vises i <strong clas…

Discussion

Denne protokollen kan benyttes for visuell verifisering av eventuelle rekombinante Ab eller rekombinant protein produsert i N. benthamiana planter, inkludert de som krever midlertidig eksponering for sure miljøer for kolonnerensing formål^42,43,44. Videre kan fusjonen av asGFP til andre proteiner i forskjellige uttrykkssystemer være et nyttig verktøy for eksperimentell visualisering og utdanning. Protokollen heri kan…

Materials

5 mL syringe	any	N/A
50 mL syringe	any	N/A
Agar	SIGMA-ALDRICH	A5306
Blender with cups	any	N/A
Bromophenol blue	Bio-Rad	1610404
DTT (DL-Dithiothreitol)	MP BIOMEDICALS	219482101
EDTA (Ethylenedinitrilo)tetraacetic acid	SIGMA-ALDRICH	E-6760
Ethanol	any	N/A
Glycerol	G-Biosciences	BTNM-0037
Glycine	SIGMA-ALDRICH	G7126-500G
HCl (Hydrochloric acid)	EMD MILLIPORE CORPORATION	HX0603-4
Heating block	any reputable supplier	N/A
Jiffy-7 727 w/hole peat pellets	Hummert International	14237000
Kanamycin	Gold Biotechnology Inc	K-120-100
KCl (Potassium Chloride)	SIGMA-ALDRICH	P9541-500G
KH2PO4 (Potassium Phosphate)	J.t.baker	3248-05
KOH (Potassium Hydroxide)	VWR	BDH0262
Magnesium sulfate heptahydrate	SIGMA-ALDRICH	M2773
MES (2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid)	SIGMA-ALDRICH	M8250
Miracloth	Millipore	4 75855-1R
Moisture control potting mix	Miracle-Gro	755783
Na2HPO4 (Sodium Phosphate)	J.t.baker	3827-01
NaCl (Sodium Chloride)	Santa Cruz Biotechnology	sc-203274C
Nicotiana benthamiana seeds	any reputable supplier	N/A
PMSF (Phenylmethylsulfonyl Fluoride)	G-Biosciences	786-787
Polypropylene Column	any	N/A
Precision Plus Protein Dual Color Standards	Bio-Rad	1610394
Protein G resin	Thermo Fisher Scientific	20399
Rifampicin	Gold Biotechnology Inc	R-120-25
SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)	G-Biosciences	DG093
Sodium Ascorbate	SIGMA-ALDRICH	A7631-500G
Spectrophotometer	any reputable supplier	N/A
Titan3 0.75 µm glass fiber filter	ThermoScientific	40725-GM
Tray for peat pellets with dome	any	N/A
TRIS Base	J.t.baker	4109-02
Tris-HCl	Amresco	M108-1KG
Tryptone	SIGMA-ALDRICH	17221
UV lamp	any	N/A
Water Soluble All Purpose Plant Food	Miracle-Gro	2000992
Yeast extract	SIGMA-ALDRICH	9182