Produktion von IgG-Fusionsproteinen transient exprimiert in Nicotiana benthamiana

Summary

Wir beschreiben hier eine einfache Methode für die Expression, Extraktion und Reinigung von rekombinantem menschlichen IgG, das mit GFP in Nicotiana benthamianaverschmolzen wird. Dieses Protokoll kann auf die Reinigung und Visualisierung zahlreicher Proteine erweitert werden, die die Säulenchromatographie nutzen. Darüber hinaus ist das Protokoll an das persönlich und virtuelle College-Lehrlabor anpassbar und bietet projektbasierte Erkundungen.

Abstract

Die hohe Nachfrage nach Antikörpern als therapeutische Interventionen für verschiedene infektiöse, metabolische, autoimmune, neoplastische und andere Krankheiten erzeugt einen wachsenden Bedarf an der Entwicklung effizienter Methoden für die rekombinante Antikörperproduktion. Im Jahr 2019 gab es mehr als 70 FDA-zugelassene monoklonale Antikörper, und es gibt exponentielles Wachstumspotenzial. Trotz ihres Versprechens sind die Herstellungskosten und die Komplexität die Produktionskosten und die Komplexität begrenzend. Potenziell bieten Anlagen kostengünstige, sichere und leicht skalierbare Proteinherstellungsstrategien. Pflanzen wie Nicotiana benthamiana können nicht nur komplexe Säugetierproteine richtig falten und zusammenfügen, sondern auch kritische posttranslationale Modifikationen hinzufügen, die denen von Säugetierzellkulturen ähneln. In dieser Arbeit konnten wir mit nativem GFP und einer säurestabilen Variante des grünen fluoreszierenden Proteins (GFP), die mit menschlichen monoklonalen Antikörpern verschmolzen ist, den gesamten transienten Antikörperexpression und -reinigungsprozess aus N. benthamiana-Pflanzen visualisieren. Je nach Zweck des Experiments kann die native GFP-Fusion eine einfachere Visualisierung während der Expressionsphase in den Pflanzen gewährleisten, während die säurestabile GFP-Fusion eine Visualisierung während der Nachverarbeitung ermöglicht. Dieses skalierbare und unkomplizierte Verfahren kann von einem einzelnen Forscher durchgeführt werden, um Milligramm-Mengen an hochreinen Antikörper- oder Antikörperfusionsproteinen innerhalb weniger Tage mit nur wenigen kleinen Pflanzen herzustellen. Eine solche Technik kann auf die Visualisierung jeder Art von Antikörper-Reinigungsprozess und potenziell viele andere Proteine erweitert werden, sowohl in pflanzlichen als auch in anderen Expressionssystemen. Darüber hinaus können diese Techniken virtuellen Anweisungen zugute kommen und in einem Lehrlabor von Studenten durchgeführt werden, die über minimale Vorkenntnisse mit molekularbiologischen Techniken verfügen und eine Grundlage für projektbasierte Sonnungen mit realen Anwendungen bieten.

Introduction

Branchenberichten zufolge handelte es sich bei dreizehn der zwanzig am höchsten einumsatzreichsten Arzneimittel in den Vereinigten Staaten um Biologika (Protein-basierte Arzneimittel), von denen neun Antikörper waren. Im Jahr 2019 gab es über 570 Antikörper (Ab) Therapeutika in verschiedenen klinischen Entwicklungsphasen^1,2,3. Der aktuelle weltweite Ab-Umsatz übersteigt 100 Milliarden US-Dollar, und der monoklonale Ab (mAb) therapeutische Markt wird bis 2025 voraussichtlich bis zu 300 Milliarden US-Dollar generieren^1,4. Angesichts der hohen Nachfrage und der prognostizierten Umsatzsteigerungen haben forscher daran gearbeitet, Wege zu entwickeln, Ab-Therapeutika in immer größerem Maßstab zu produzieren, mit höherer Qualität und niedrigeren Kosten. Pflanzenbasierte Expressionssysteme haben mehrere Vorteile gegenüber traditionellen Säugetierzelllinien für die erschwingliche und großflächige Herstellung von Ab-Therapeutika^5,6. Die Herstellung von Proteintherapeutika in Pflanzen (“molekulares Pharming”) erfordert keine teuren Bioreaktoren oder Zellkulturanlagen wie die traditionellen Säugetierzellkulturtechniken^7,8. Pflanzen können sich keine menschlichen Krankheitserreger anstecken, wodurch eine mögliche Kontamination minimiert wird⁹. Sowohl die transiente als auch die transgene pflanzliche Proteinexpression können als kostengünstigere Alternativen zu Säugetier- oder Bakterienproduktionssystemen verwendet werden¹⁰. Obwohl transgene Pflanzen für die Pflanzenproduktion bevorzugt werden, kann die rekombinante Proteinproduktion mit dieser Methode Wochen bis Monate in Anspruch erfordern. Fortschritte in der transienten Expression mit viralen Vektoren durch Spritze oder Vakuum-Agroinfiltration ermöglichen eine kleine bzw. großflächige Produktion des gewünschten Proteins in Tagen^11,12,13,14. Die Produktion von mAbs gegen Ebola, Dengue und, Zika und zahlreiche andere rekombinante Proteine wurden schnell und effizient mit transienter Expression in N. benthamiana Pflanzen^{15,16,17,18,19}hergestellt und gereinigt. Diese Umstände machen vorübergehende pflanzenbasierte Expression zu einer attraktiven Option für die Entwicklung mehrerer Ab-Therapeutika und der in diesem Protokoll²⁰demonstrierten Methoden.

MAbs der ersten Generation waren von muriner Ableitung, was zu einer unspezifischen Immunogenität führte, wenn sie in Studien am Menschen verwendet wurde²¹. Im Laufe der Zeit wurden chimäre, humanisierte und schließlich vollständig menschliche Abs produziert, um die durch Ab-Therapeutika induzierte Immunogenität zu mindern. Leider verursachen einige dieser Abs immer noch Wirtsimmunogenität aufgrund von Unterschieden in der Glykosylierung²¹. Entwicklungen im Anlagenbau haben die Modifikation von Abglycanen ermöglicht, was unerlässlich ist, da die Stabilität und Funktion eines Ab durch seinen Glykosylierungszustand erheblich beeinträchtigt werden kann²². Fortschritte haben die Produktion von hochgradig erdtämmigen Humangups, die menschliche Glykane und daraus resultierend die gewünschten biologischen Merkmale eines massenproduzierten Humanarzneimittels enthalten, in Pflanzensystemen ermöglicht^19,21.

Neben rekombinanten Abs wurden in den letzten Jahrzehnten auch Ab-Fusionsmoleküle (Ab-Fusionen) für verschiedene Zwecke erforscht. Ab-Fusionen bestehen oft aus einem Ab- oder Ab-Fragment, das mit einem Molekül oder Protein verschmolzen ist, und sind so konzipiert, dass sie Reaktionen aus Immuneffektorzellen entlocken²³. Diese Moleküle wurden als mögliche therapeutische Interventionen zur Behandlung verschiedener Pathologien wie Krebs und Autoimmunerkrankungen^24,25,26,27geschaffen. Rekombinante Immunkomplexe (RICs) sind eine weitere Klasse von Ab-Fusionen, die als Impfstoffkandidaten eingesetzt wurden²⁸. RICs nutzen die Fähigkeit des Immunsystems, Fc-Regionen von Ab-Fusionen zu erkennen und haben festgestellt, dass sie die Immunogenität verbessern, wenn sie mit anderen Impfstoffplattformen kombiniert werden^29,30,31.

Green Fluorescent Protein (GFP) ist ein biolumineszierendes Protein aus der Qualle Aequorea Victoria, die grünes Licht aussendet, wenn sie von ultraviolettem Licht angeregt wird^32,33. Im Laufe der Jahre hat sich die Verwendung von GFP als visueller Marker der Genexpression von der Expression in Escherichia coli auf zahlreiche Proteinexpressionssysteme ausgeweitet, darunter N. Benthamiana-Pflanzen ^{34,35,36,37,38}. Sichtbare Marker wie GFP haben reichlich Auswirkungen auf das Lehren und Erlernen wissenschaftlicher Konzepte. Zahlreiche Einsteiger beschreiben Schwierigkeiten beim Verständnis wissenschaftlicher Konzepte, wenn die gelehrte Idee mit bloßem Auge nicht sichtbar ist, wie die Konzepte der Molekularbiologie und verwandter Felder³⁹. Visuelle Marker, wie GFP, können somit zur Verarbeitung von Informationen im Zusammenhang mit den wissenschaftlichen Prozessen beitragen und dazu beitragen, die Schwierigkeiten zu lindern, die Studenten beim Erlernen zahlreicher wissenschaftlicher Konzepte melden.

Obwohl GFP oft als Marker verwendet wird, um Gen und Expression in vivoanzuzeigen, ist es schwierig, es in den nachgelagerten Prozessen zu visualisieren, wenn saure Bedingungen verwendet werden. Dieser Umstand liegt in erster Linie daran, dass das GFP seine Struktur und die resultierende Fluoreszenz bei einem niedrigen^{pH-Wert von 40}nicht aufrechterhält. Vorübergehende saure Umgebungen sind oft in verschiedenen Reinigungsprozessen erforderlich, wie Protein G, Protein A und Protein L Chromatographie, oft für Ab-Reinigung^41,42,43,44verwendet. GFP-Mutanten wurden verwendet, um Fluoreszenz unter sauren Bedingungen zu behalten^45,46.

Hierin beschreiben wir eine einfache Methode zur Expression, Extraktion und Reinigung rekombinanter IgG-Fusionsproteine in N. benthamiana-Pflanzen. Wir produzierten traditionelle GFP, die mit dem N-Terminus einer humanisierten IgG-Schwerenkette verschmolzen wurde, wodurch eine GFP-IgG-Fusion entstand. Gleichzeitig entwickelten wir die Verschmelzung einer pflanzenkodonoptimierten Sequenz für ein säurestabiles GFP (asGFP) zum N-Terminus einer humanisierten IgG-Schwerkette, wodurch eine asGFP-IgG-Fusion entsteht. Zu den Vorteilen der Herstellung von GFP-IgG gehört die Möglichkeit, das Vorhandensein eines Zielproteins während der Expression zu visualisieren, während als GFP-IgG das Vorhandensein von rekombinantem Protein nicht nur in den Expressions- und Extraktionsschritten, sondern auch in den Reinigungsschritten des Proteins sieht. Dieses Protokoll kann für die Herstellung, Reinigung und Visualisierung einer Reihe von GFP-Fusionsproteinen angepasst werden, die in N. benthamiana hergestellt und mit Chromatographie-Techniken gereinigt werden, die einen niedrigen pH-Wert erfordern. Der Prozess kann auch auf verschiedene Mengen an Blattmaterial zugeschnitten werden. Während Abs und Fusionsproteine, die mit GFP oder asGFP markiert sind, nicht für Therapien verwendet werden sollen, können diese Methoden als Kontrollen während der Experimente nützlich sein und können auch als Lehrmittel für molekulare und zelluläre Biologie und Biotechnologie weiter genutzt werden, sowohl persönlich als auch virtuell.

Protocol

1. Kultivieren N. benthamiana Pflanzen Bodentorfpellets auf eine Schale legen und zuvor gekochtes, noch heißes Wasser über die Torfpellets gießen, um sie vollständig auszupflanzen. Nachdem Pellets vollständig erweitert sind, legen Sie 2-3 N. Benthamiana Samen auf jedem Torfpellet mit Pinzette. Gießen Sie etwa 0,5 in Wasser, um den Boden des Tabletts zu bedecken. Beschriften Sie das Fach mit dem Aussaatdatum. Die Sämlinge täglich mit entsprech…

Representative Results

Diese Studie zeigt eine einfache und schnelle Methode zur Herstellung rekombinanter Proteine und deren Visualisierung in allen nachgelagerten Prozessen. Mit N. benthamiana und nach dem bereitgestellten Protokoll kann die hier beschriebene rekombinante Proteinproduktion in weniger als einer Woche erreicht werden. Der gesamte Arbeitsablauf von Pflanzenexpression, Extraktion und Reinigung ist in Abbildung 1dargestellt. Die Stadien des Pflanzenwachstums von 2 Wochen alten Sämlingen, 4 …

Discussion

Dieses Protokoll kann für die visuelle Überprüfung von rekombinanten Ab oder rekombinanten Protein enduden in N. benthamiana Pflanzen verwendet werden, einschließlich derjenigen, die vorübergehende Exposition gegenüber sauren Umgebungen für Säulenreinigung Zwecke^42,43,44. Darüber hinaus kann die Fusion von asGFP mit anderen Proteinen in verschiedenen Expressionssystemen ein nützliches Werkzeug für experimente…

Materials

5 mL syringe	any	N/A
50 mL syringe	any	N/A
Agar	SIGMA-ALDRICH	A5306
Blender with cups	any	N/A
Bromophenol blue	Bio-Rad	1610404
DTT (DL-Dithiothreitol)	MP BIOMEDICALS	219482101
EDTA (Ethylenedinitrilo)tetraacetic acid	SIGMA-ALDRICH	E-6760
Ethanol	any	N/A
Glycerol	G-Biosciences	BTNM-0037
Glycine	SIGMA-ALDRICH	G7126-500G
HCl (Hydrochloric acid)	EMD MILLIPORE CORPORATION	HX0603-4
Heating block	any reputable supplier	N/A
Jiffy-7 727 w/hole peat pellets	Hummert International	14237000
Kanamycin	Gold Biotechnology Inc	K-120-100
KCl (Potassium Chloride)	SIGMA-ALDRICH	P9541-500G
KH2PO4 (Potassium Phosphate)	J.t.baker	3248-05
KOH (Potassium Hydroxide)	VWR	BDH0262
Magnesium sulfate heptahydrate	SIGMA-ALDRICH	M2773
MES (2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid)	SIGMA-ALDRICH	M8250
Miracloth	Millipore	4 75855-1R
Moisture control potting mix	Miracle-Gro	755783
Na2HPO4 (Sodium Phosphate)	J.t.baker	3827-01
NaCl (Sodium Chloride)	Santa Cruz Biotechnology	sc-203274C
Nicotiana benthamiana seeds	any reputable supplier	N/A
PMSF (Phenylmethylsulfonyl Fluoride)	G-Biosciences	786-787
Polypropylene Column	any	N/A
Precision Plus Protein Dual Color Standards	Bio-Rad	1610394
Protein G resin	Thermo Fisher Scientific	20399
Rifampicin	Gold Biotechnology Inc	R-120-25
SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)	G-Biosciences	DG093
Sodium Ascorbate	SIGMA-ALDRICH	A7631-500G
Spectrophotometer	any reputable supplier	N/A
Titan3 0.75 µm glass fiber filter	ThermoScientific	40725-GM
Tray for peat pellets with dome	any	N/A
TRIS Base	J.t.baker	4109-02
Tris-HCl	Amresco	M108-1KG
Tryptone	SIGMA-ALDRICH	17221
UV lamp	any	N/A
Water Soluble All Purpose Plant Food	Miracle-Gro	2000992
Yeast extract	SIGMA-ALDRICH	9182