JoVE Journal > Cancer Research
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Recherche en cancérologie

Isolierung und funktionelle Beurteilung menschlicher Brustkrebsstammzellen aus Zell- und Gewebeproben

Published: October 02, 2020
doi:
10.3791/61775
, , , ,
1London Regional Cancer Program, 2Department of Anatomy & Cell Biology,Western University, 3Department of Oncology,Western University, 4Lawson Health Research Institute

Summary

Dieses experimentelle Protokoll beschreibt die Isolierung von BCSCs aus Brustkrebszell- und Gewebeproben sowie die in vitro und in vivo Assays, die zur Beurteilung des BCSC-Phänotyps und der BCSC-Funktion verwendet werden können.

Abstract

Brustkrebsstammzellen (BCSCs) sind Krebszellen mit vererbten oder erworbenen stammzellähnlichen Eigenschaften. Trotz ihrer geringen Häufigkeit tragen sie wesentlich zur Entstehung, zum Rückfall, zur Metastasierung und zur Therapieresistenz von Brustkrebs bei. Es ist unerlässlich, die Biologie von Brustkrebsstammzellen zu verstehen, um neue therapeutische Ziele zur Behandlung von Brustkrebs zu identifizieren. Brustkrebsstammzellen werden isoliert und charakterisiert, basierend auf der Expression einzigartiger Zelloberflächenmarker wie CD44, CD24 und der enzymatischen Aktivität der Aldehyddehydrogenase (ALDH). Diese ALDHHighCD44+CD24- Zellen bilden die BCSC-Population und können durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) für nachgeschaltete funktionelle Studien isoliert werden. Je nach wissenschaftlicher Fragestellung können unterschiedliche in vitro und in vivo Methoden verwendet werden, um die funktionellen Eigenschaften von BCSCs zu beurteilen. Hier stellen wir ein detailliertes experimentelles Protokoll zur Isolierung von humanen BCSCs sowohl aus heterogenen Populationen von Brustkrebszellen als auch aus primärem Tumorgewebe von Brustkrebspatientinnen zur Verfügung. Darüber hinaus heben wir nachgeschaltete In-vitro – und In-vivo-Funktionstests hervor, einschließlich koloniebildender Assays, Mammosphären-Assays, 3D-Kulturmodelle und Tumor-Xenograft-Assays, die zur Beurteilung der BCSC-Funktion verwendet werden können.

Introduction

Das Verständnis der zellulären und molekularen Mechanismen menschlicher Brustkrebsstammzellen (BCSCs) ist entscheidend, um die Herausforderungen bei der Brustkrebsbehandlung zu bewältigen. Die Entstehung des BCSC-Konzepts geht auf das frühe 21. Jahrhundert zurück, als eine kleine Population von CD44+CD24-/niedrigen Brustkrebszellen in der Lage war, heterogene Tumore in Mäusen zu erzeugen 1,2. Anschließend wurde beobachtet, dass menschliche Brustkrebszellen mit hoher enzymatischer Aktivität der Aldehyddehydrogenase (ALDHhigh) ebenfalls ähnliche stammzellähnliche Eigenschaften aufwiesen3. Diese BCSCs stellen eine kleine Population von Zellen dar, die zur Selbsterneuerung und Differenzierung fähig sind, was zur heterogenen Natur von Massentumoren beiträgt 1,2,3. Zunehmende Beweise deuten darauf hin, dass Veränderungen in evolutionär konservierten Signalwegen das Überleben und die Aufrechterhaltung von BCSC vorantreiben 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14 . Darüber hinaus hat sich gezeigt, dass die extrinsische Mikroumgebung der Zelle eine entscheidende Rolle bei der Bestimmung verschiedener BCSC-Funktionen spielt15,16,17. Diese molekularen Signalwege und die externen Faktoren, die die BCSC-Funktion regulieren, tragen zum Rückfall von Brustkrebs, zur Metastasierung18 und zur Entwicklung von Therapieresistenzen bei 19,20,21, wobei die Restexistenz von BCSCs nach der Behandlung eine große Herausforderung für das Gesamtüberleben von Brustkrebspatientinnen darstellt22,23 . Die präklinische Bewertung dieser Faktoren ist daher sehr wichtig, um BCSC-zielgerichtete Therapien zu identifizieren, die für bessere Behandlungsergebnisse und ein verbessertes Gesamtüberleben bei Brustkrebspatientinnen von Vorteil sein könnten.

Mehrere in vitro menschliche Brustkrebs-Zelllinienmodelle und in vivo menschliche Xenograft-Modelle wurden verwendet, um BCSCs 24,25,26,27,28,29 zu charakterisieren. Die Fähigkeit von Zelllinien, sich nach jeder nachfolgenden Passage kontinuierlich neu zu besiedeln, macht diese zu einem idealen Modellsystem für die Durchführung von Omics-basierten und pharmakogenomischen Studien. Zelllinien können jedoch die in Patientenproben beobachtete Heterogenität oft nicht rekapitulieren. Daher ist es wichtig, Zellliniendaten mit Patientenproben zu ergänzen. Die Isolierung von BCSCs in ihrer reinsten Form ist wichtig, um eine detaillierte Charakterisierung von BCSCs zu ermöglichen. Das Erreichen dieser Reinheit hängt von der Auswahl der phänotypischen Marker ab, die für BCSCs spezifisch sind. Derzeit wird der ALDH-Zellphänotypmit hohemCD44+CD24-Zellgehalt am häufigsten verwendet, um humane BCSCs aus Massen-Brustkrebszellpopulationen zu unterscheiden und zu isolieren, wobei Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) für maximale Reinheit verwendet wird 1, 3,26. Darüber hinaus können die Eigenschaften isolierter BCSCs wie Selbsterneuerung, Proliferation und Differenzierung mit in vitro und in vivo Techniken bewertet werden.

Zum Beispiel können In-vitro-Koloniebildungsassays verwendet werden, um die Fähigkeit einer einzelnen Zelle zu beurteilen, sich selbst zu erneuern, um eine Kolonie von 50 Zellen oder mehr bei unterschiedlichen Behandlungsbedingungen zu bilden30. Mammosphären-Assays können auch verwendet werden, um das Selbsterneuerungspotenzial von Brustkrebszellen unter verankerten Bedingungen zu beurteilen. Dieser Assay misst die Fähigkeit einzelner Zellen, bei jeder nachfolgenden Passage unter serumfreien, nicht adhärenten Kulturbedingungen als Kugeln (Mischung aus BCSCs und Nicht-BCSCs) zu erzeugen und zu wachsen31. Darüber hinaus können 3-dimensionale (3D) Kulturmodelle verwendet werden, um die BCSC-Funktion zu bewerten, einschließlich Zell-Zell- und Zell-Matrix-Interaktionen, die die In-vivo-Mikroumgebung genau rekapitulieren und die Untersuchung der Aktivität potenzieller BCSC-zielgerichteter Therapien ermöglichen32. Trotz der vielfältigen Anwendungen von In-vitro-Modellen ist es schwierig, die Komplexität von In-vivo-Bedingungen nur mit In-vitro-Assays zu modellieren. Diese Herausforderung kann durch die Verwendung von Maus-Xenograft-Modellen zur Bewertung des BCSC-Verhaltens in vivo überwunden werden. Insbesondere dienen solche Modelle als ideales System zur Beurteilung der Brustkrebsmetastasierung33, zur Untersuchung von Wechselwirkungen mit der Mikroumgebung während des Krankheitsverlaufs 34, zur In-vivo-Bildgebung 35 und zur Vorhersage der patientenspezifischen Toxizität und Wirksamkeit von Antitumorwirkstoffen 34.

Dieses Protokoll bietet eine detaillierte Beschreibung für die Isolierung von humanen ALDHhohenCD44+CD24– BCSCs in maximaler Reinheit aus Massenpopulationen heterogener Brustkrebszellen. Wir bieten auch eine detaillierte Beschreibung von drei In-vitro-Techniken (koloniebildender Assay, Mammosphärentest und 3D-Kulturmodell) und einen In-vivo-Tumor-Xenograft-Assay, der zur Beurteilung verschiedener Funktionen von BCSCs verwendet werden kann. Diese Methoden wären für Forscher geeignet, die an der Isolierung und Charakterisierung von BCSCs aus menschlichen Brustkrebszelllinien oder primär von Patienten abgeleiteten Brustkrebszellen und Tumorgewebe interessiert sind, um die BCSC-Biologie zu verstehen und/oder neuartige BCSC-zielgerichtete Therapien zu untersuchen.

Protocol

Die Entnahme von chirurgischen oder Biopsieproben von Patienten, die direkt von einwilligenden Brustkrebspatientinnen stammten, wurde nach einem genehmigten humanethischen Protokoll durchgeführt, das vom Institutional Ethic Board genehmigt wurde. Alle Mäuse, die zur Erstellung von von Patienten abgeleiteten Xenograft-Modellen verwendet wurden, wurden gepflegt und in einer von der Institution zugelassenen Tiereinrichtung untergebracht. Das Tumorgewebe aus patientenabgeleiteten Xenograft-Modellen mit Mäusen wurde gemä?…

Representative Results

Das beschriebene Protokoll ermöglicht die Isolierung humaner BCSCs aus einer heterogenen Population von Brustkrebszellen, entweder aus Zelllinien oder aus dissoziiertem Tumorgewebe. Für jede gegebene Zelllinie oder Gewebeprobe ist es entscheidend, eine einheitliche Einzelzellsuspension zu erzeugen, um BCSCs mit maximaler Reinheit zu isolieren, da die Kontamination von Nicht-BCSC-Populationen zu variablen zellulären Reaktionen führen könnte, insbesondere wenn das Studienziel darin besteht, die Wirksamkeit von Therape…

Discussion

Brustkrebsmetastasen und Therapieresistenzen sind weltweit zu einer Haupttodesursache bei Frauen geworden. Die Existenz einer Subpopulation von Brustkrebsstammzellen (BCSCs) trägt zur verstärkten Metastasierung 26,43,44,45,46 und Therapieresistenz21,47,48 bei. Daher…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken den Mitgliedern unseres Labors für ihre hilfreichen Gespräche und Unterstützung. Unsere Forschung zu Brustkrebsstammzellen und der Tumormikroumgebung wird durch Zuschüsse des Canadian Cancer Research Society Research Institute und des Brustkrebsprogramms des US-Verteidigungsministeriums (Grant # BC160912) finanziert. V.B. wird durch ein Western Postdoctoral Fellowship (Western University) unterstützt, und sowohl A.L.A. als auch V.B. werden von der Breast Cancer Society of Canada unterstützt. C.L. wird durch ein Vanier Canada Graduate Scholarship der kanadischen Regierung unterstützt.

Materials

7-Aminoactinomycin D (7AAD) BD 51-68981E suggested: 0.25 µg/1×106 cells
Acetone Fisher A18-1
Aldehyde dehydrogenase (ALDH) substrate Stemcell Technologies 1700 Sold commerically as part of the ALDEFLOUR Assay kit; follow manufacturer's instructions for ALDH substrate preparation
Basement membrane extract (BME) Corning 354234 Sold under the commercial name Matrigel
Cell culture plates: 6 well Corning 877218
Cell culture plates: 60mm Corning 353002
Cell culture plates: 96-well ultra low attachment Corning 3474
Cell strainer: 40 micron BD 352340
Collagen Stemcell Technologies 7001 Prepare 1:30 dilution of 3 mg/mL collagen in PBS
Collagenase Sigma 11088807001 1x
Conical tubes: 50 mL Fisher scientific 05-539-7
Crystal violet Sigma C6158 Use 0.05% crystal violet solution in water for staining
Dispase Stemcell Technologies 7913 5U/mL
DMEM:F12 Gibco 11330-032 1x, With L-glutamine and 15 mM HEPES
DNAse Sigma D5052 0.1 mg/mL final concentration
FBS Avantor Seradigm Lifescience 97068-085  
Flow tubes: 5ml BD 352063 Polypropylene round-bottom tubes
Methanol Fisher 84124
mouse anti-Human CD24 antibody BD 561646 R-phycoerythrin and Cyanine dye conjugated Clone: ML5
mouse anti-Human CD44 antibody BD 555479 R-phycoerythrin conjugated, Clone: G44-26
N,N-diethylaminobenzaldehyde (DEAB) Stemcell Technologies 1700 Sold commerically as part of the ALDEFLOUR Assay kit; follow manufacturer's instructions DEAB preparation
PBS Wisent Inc 311-425-CL 1x, Without calcium and magnesium
Trypsin-EDTA Gibco 25200-056
Mammosphere Media Composition
B27 Gibco 17504-44 1x
bFGF Sigma F2006 10 ng/mL
BSA Bioshop ALB003 04%
DMEM:F12 Gibco 11330-032 1x, With L-glutamine and 15 mM HEPES
EGF Sigma E9644 20 ng/mL
Insulin Sigma 16634 5 µg/mL
3D Organoid Media Composition
A8301 Tocris 2939 500 nM
B27 Gibco 17504-44 1x
DMEM:F12 Gibco 11330-032 1x, With L-glutamine and 15 mM HEPES
EGF Sigma E9644 5 ng/mL
FGF10 Peprotech 100-26 20 ng/mL
FGF7 Peprotech 100-19 5 ng/mL
GlutaMax Invitrogen 35050-061 1x
HEPES Gibco 15630-080 10 mM
N-acetylcysteine Sigma A9165 1.25 mM
Neuregulin β1 Peprotech 100-03 5 nM
Nicotinamide Sigma N0636 5 mM
Noggin Peprotech 120-10C 100 ng/mL
R-spondin3 R&D 3500 250 ng/mL
SB202190 Sigma S7067 500 nM
Y-27632 Tocris 1254 5 µM
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (7), 3983-3988 (2003).
  2. Shipitsin, M., et al. Molecular definition of breast tumor heterogeneity. Cancer Cell. 11 (3), 259-273 (2007).
  3. Ginestier, C., et al. ALDH1 is a marker of normal and malignant human mammary stem cells and a predictor of poor clinical outcome. Cell Stem Cell. 1 (5), 555-567 (2007).
  4. Sulaiman, A., et al. Dual inhibition of Wnt and Yes-associated protein signaling retards the growth of triple-negative breast cancer in both mesenchymal and epithelial states. Molecular Oncology. 12 (4), 423-440 (2018).
  5. Debeb, B. G., et al. Histone deacetylase inhibitors stimulate dedifferentiation of human breast cancer cells through WNT/β-catenin signaling. Stem Cells. 30 (11), 2366-2377 (2012).
  6. Klutzny, S., et al. PDE5 inhibition eliminates cancer stem cells via induction of PKA signaling. Cell Death & Disease. 9 (2), 192 (2018).
  7. DiMeo, T. A., et al. A novel lung metastasis signature links Wnt signaling with cancer cell self-renewal and epithelial-mesenchymal transition in basal-like breast cancer. Recherche en cancérologie. 69 (13), 5364-5373 (2009).
  8. Liu, C. C., Prior, J., Piwnica-Worms, D., Bu, G. LRP6 overexpression defines a class of breast cancer subtype and is a target for therapy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (11), 5136-5141 (2010).
  9. Miller-Kleinhenz, J., et al. Dual-targeting Wnt and uPA receptors using peptide conjugated ultra-small nanoparticle drug carriers inhibited cancer stem-cell phenotype in chemo-resistant breast cancer. Biomaterials. 152, 47-62 (2018).
  10. Mamaeva, V., et al. Inhibiting Notch Activity in Breast Cancer Stem Cells by Glucose Functionalized Nanoparticles Carrying γ-secretase Inhibitors. Molecular Therapy. 24 (5), 926-936 (2016).
  11. Ithimakin, S., et al. HER2 drives luminal breast cancer stem cells in the absence of HER2 amplification: implications for efficacy of adjuvant trastuzumab. Recherche en cancérologie. 73 (5), 1635-1646 (2013).
  12. Koike, Y., et al. Anti-cell growth and anti-cancer stem cell activities of the non-canonical hedgehog inhibitor GANT61 in triple-negative breast cancer cells. Breast Cancer. 24 (5), 683-693 (2017).
  13. Sun, Y., et al. Estrogen promotes stemness and invasiveness of ER-positive breast cancer cells through Gli1 activation. Molecular Cancer. 13, 137 (2014).
  14. Colavito, S. A., Zou, M. R., Yan, Q., Nguyen, D. X., Stern, D. F. Significance of glioma-associated oncogene homolog 1 (GLI1) expression in claudin-low breast cancer and crosstalk with the nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells (NFκB) pathway. Breast Cancer Research. 16 (5), 444 (2014).
  15. Bhat, V., Allan, A. L., Raouf, A. Role of the Microenvironment in Regulating Normal and Cancer Stem Cell Activity: Implications for Breast Cancer Progression and Therapy Response. Cancers. 11 (9), (2019).
  16. Pio, G. M., Xia, Y., Piaseczny, M. M., Chu, J. E., Allan, A. L. Soluble bone-derived osteopontin promotes migration and stem-like behavior of breast cancer cells. PloS One. 12 (5), 0177640 (2017).
  17. Chu, J. E., et al. Lung-derived factors mediate breast cancer cell migration through CD44 receptor-ligand interactions in a novel ex vivo system for analysis of organ-specific soluble proteins. Neoplasia. 16 (2), 180-191 (2014).
  18. McGowan, P. M., et al. Notch1 inhibition alters the CD44hi/CD24lo population and reduces the formation of brain metastases from breast cancer. Molecular Cancer Research. 9 (7), 834-844 (2011).
  19. Mao, J., et al. ShRNA targeting Notch1 sensitizes breast cancer stem cell to paclitaxel. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 45 (6), 1064-1073 (2013).
  20. Duru, N., et al. HER2-associated radioresistance of breast cancer stem cells isolated from HER2-negative breast cancer cells. Clinical Cancer Research. 18 (24), 6634-6647 (2012).
  21. Croker, A. K., Allan, A. L. Inhibition of aldehyde dehydrogenase (ALDH) activity reduces chemotherapy and radiation resistance of stem-like ALDHhiCD44+ human breast cancer cells. Breast Cancer Research and Treatment. 133 (1), 75-87 (2012).
  22. Creighton, C. J., et al. Residual breast cancers after conventional therapy display mesenchymal as well as tumor-initiating features. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (33), 13820-13825 (2009).
  23. Calcagno, A. M., et al. Prolonged drug selection of breast cancer cells and enrichment of cancer stem cell characteristics. Journal of the National Cancer Institute. 102 (21), 1637-1652 (2010).
  24. Feng, Y., et al. Breast cancer development and progression: Risk factors, cancer stem cells, signaling pathways, genomics, and molecular pathogenesis. Genes Dis. 5 (2), 77-106 (2018).
  25. Samanta, D., Gilkes, D. M., Chaturvedi, P., Xiang, L., Semenza, G. L. Hypoxia-inducible factors are required for chemotherapy resistance of breast cancer stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (50), 5429-5438 (2014).
  26. Croker, A. K., et al. High aldehyde dehydrogenase and expression of cancer stem cell markers selects for breast cancer cells with enhanced malignant and metastatic ability. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 13 (8), 2236-2252 (2009).
  27. Morel, A. P., et al. Generation of breast cancer stem cells through epithelial-mesenchymal transition. PloS One. 3 (8), 2888 (2008).
  28. Muntimadugu, E., Kumar, R., Saladi, S., Rafeeqi, T. A., Khan, W. CD44 targeted chemotherapy for co-eradication of breast cancer stem cells and cancer cells using polymeric nanoparticles of salinomycin and paclitaxel. Colloids Surf B Biointerfaces. 143, 532-546 (2016).
  29. Liu, S., et al. Breast cancer stem cells transition between epithelial and mesenchymal states reflective of their normal counterparts. Stem Cell Reports. 2 (1), 78-91 (2014).
  30. Munshi, A., Hobbs, M., Meyn, R. E. Clonogenic cell survival assay. Methods in Molecular Medicine. 110, 21-28 (2005).
  31. Shaw, F. L., et al. A detailed mammosphere assay protocol for the quantification of breast stem cell activity. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 17 (2), 111-117 (2012).
  32. Shin, C. S., Kwak, B., Han, B., Park, K. Development of an in vitro 3D tumor model to study therapeutic efficiency of an anticancer drug. Molecular Pharmaceutics. 10 (6), 2167-2175 (2013).
  33. Khanna, C., Hunter, K. Modeling metastasis in vivo. Carcinogenesis. 26 (3), 513-523 (2005).
  34. Cheon, D. J., Orsulic, S. Mouse models of cancer. Annual Review of Pathology. 6, 95-119 (2011).
  35. Lyons, S. K. Advances in imaging mouse tumour models in vivo. Journal of Pathology. 205 (2), 194-205 (2005).
  36. Margaryan, N. V., et al. The Stem Cell Phenotype of Aggressive Breast Cancer Cells. Cancers. 11 (3), (2019).
  37. Ma, F., et al. Enriched CD44(+)/CD24(-) population drives the aggressive phenotypes presented in triple-negative breast cancer (TNBC). Cancer Letters. 353 (2), 153-159 (2014).
  38. Chatterjee, S., et al. Paracrine Crosstalk between Fibroblasts and ER(+) Breast Cancer Cells Creates an IL1β-Enriched Niche that Promotes Tumor Growth. iScience. 19, 388-401 (2019).
  39. Phan-Lai, V., et al. Three-dimensional scaffolds to evaluate tumor associated fibroblast-mediated suppression of breast tumor specific T cells. Biomacromolecules. 14 (5), 1330-1337 (2013).
  40. O’Brien, C. A., Kreso, A., Jamieson, C. H. Cancer stem cells and self-renewal. Clinical Cancer Research. 16 (12), 3113-3120 (2010).
  41. Hu, Y., Smyth, G. K. ELDA: extreme limiting dilution analysis for comparing depleted and enriched populations in stem cell and other assays. Journal of Immunological Methods. 347 (1-2), 70-78 (2009).
  42. Stewart, J. M., et al. Phenotypic heterogeneity and instability of human ovarian tumor-initiating cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (16), 6468-6473 (2011).
  43. Abraham, B. K., et al. Prevalence of CD44+/CD24-/low cells in breast cancer may not be associated with clinical outcome but may favor distant metastasis. Clinical Cancer Research. 11 (3), 1154-1159 (2005).
  44. Balic, M., et al. Most early disseminated cancer cells detected in bone marrow of breast cancer patients have a putative breast cancer stem cell phenotype. Clinical Cancer Research. 12 (19), 5615-5621 (2006).
  45. Charafe-Jauffret, E., et al. Aldehyde dehydrogenase 1-positive cancer stem cells mediate metastasis and poor clinical outcome in inflammatory breast cancer. Clinical Cancer Research. 16 (1), 45-55 (2010).
  46. Marcato, P., et al. Aldehyde dehydrogenase activity of breast cancer stem cells is primarily due to isoform ALDH1A3 and its expression is predictive of metastasis. Stem Cells. 29 (1), 32-45 (2011).
  47. Lacerda, L., Pusztai, L., Woodward, W. A. The role of tumor initiating cells in drug resistance of breast cancer: Implications for future therapeutic approaches. Drug Resist Updat. 13 (4-5), 99-108 (2010).
  48. Liu, S., Wicha, M. S. Targeting breast cancer stem cells. Journal of Clinical Oncology. 28 (25), 4006-4012 (2010).
  49. D’Angelo, R. C., et al. Notch reporter activity in breast cancer cell lines identifies a subset of cells with stem cell activity. Molecular Cancer Therapeutics. 14 (3), 779-787 (2015).
  50. Neve, R. M., et al. A collection of breast cancer cell lines for the study of functionally distinct cancer subtypes. Cancer Cell. 10 (6), 515-527 (2006).
  51. Forozan, F., et al. Comparative genomic hybridization analysis of 38 breast cancer cell lines: a basis for interpreting complementary DNA microarray data. Recherche en cancérologie. 60 (16), 4519-4525 (2000).
  52. Lanier, L. L. Just the FACS. Journal of Immunology. 193 (5), 2043-2044 (2014).
  53. Ibrahim, S. F., van den Engh, G. Flow cytometry and cell sorting. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 106, 19-39 (2007).
  54. Shapiro, H. M. Flow Cytometry: The Glass Is Half Full. Methods in Molecular Biology. 1678, 1-10 (2018).
  55. Tsuji, K., et al. Effects of Different Cell-Detaching Methods on the Viability and Cell Surface Antigen Expression of Synovial Mesenchymal Stem Cells. Cell Transplantation. 26 (6), 1089-1102 (2017).
  56. Sun, C., et al. Immunomagnetic separation of tumor initiating cells by screening two surface markers. Scientific Reports. 7, 40632 (2017).
  57. Rodríguez, C. E., et al. Breast cancer stem cells are involved in Trastuzumab resistance through the HER2 modulation in 3D culture. Journal of Cellular Biochemistry. 119 (2), 1381-1391 (2018).
  58. Kim, D. W., Cho, J. Y. NQO1 is Required for β-Lapachone-Mediated Downregulation of Breast-Cancer Stem-Cell Activity. International Journal of Molecular Sciences. 19 (12), (2018).
  59. Xu, L. Z., et al. p62/SQSTM1 enhances breast cancer stem-like properties by stabilizing MYC mRNA. Oncogene. 36 (3), 304-317 (2017).
  60. Huang, X., et al. Breast cancer stem cell selectivity of synthetic nanomolar-active salinomycin analogs. BMC Cancer. 16, 145 (2016).
  61. Liu, T. J., et al. CD133+ cells with cancer stem cell characteristics associates with vasculogenic mimicry in triple-negative breast cancer. Oncogene. 32 (5), 544-553 (2013).
  62. Ponti, D., et al. Isolation and in vitro propagation of tumorigenic breast cancer cells with stem/progenitor cell properties. Recherche en cancérologie. 65 (13), 5506-5511 (2005).
  63. Velasco-Velázquez, M. A., Popov, V. M., Lisanti, M. P., Pestell, R. G. The role of breast cancer stem cells in metastasis and therapeutic implications. American Journal of Pathology. 179 (1), 2-11 (2011).
  64. Palomeras, S., Ruiz-Martínez, S., Puig, T. Targeting Breast Cancer Stem Cells to Overcome Treatment Resistance. Molecules. 23 (9), (2018).
  65. McClements, L., et al. Targeting treatment-resistant breast cancer stem cells with FKBPL and its peptide derivative, AD-01, via the CD44 pathway. Clinical Cancer Research. 19 (14), 3881-3893 (2013).
  66. Berger, D. P., Henss, H., Winterhalter, B. R., Fiebig, H. H. The clonogenic assay with human tumor xenografts: evaluation, predictive value and application for drug screening. Annals of Oncology. 1 (5), 333-341 (1990).
  67. Tian, J., et al. Dasatinib sensitises triple negative breast cancer cells to chemotherapy by targeting breast cancer stem cells. British Journal of Cancer. 119 (12), 1495-1507 (2018).
  68. Samoszuk, M., Tan, J., Chorn, G. Clonogenic growth of human breast cancer cells co-cultured in direct contact with serum-activated fibroblasts. Breast Cancer Research. 7 (3), 274-283 (2005).
  69. Linnemann, J. R., et al. Quantification of regenerative potential in primary human mammary epithelial cells. Development. 142 (18), 3239-3251 (2015).
  70. Xu, Y., Hu, Y. D., Zhou, J., Zhang, M. H. Establishing a lung cancer stem cell culture using autologous intratumoral fibroblasts as feeder cells. Cell Biology International. 35 (5), 509-517 (2011).
  71. Palmieri, C., et al. Fibroblast growth factor 7, secreted by breast fibroblasts, is an interleukin-1beta-induced paracrine growth factor for human breast cells. Journal of Endocrinology. 177 (1), 65-81 (2003).
  72. Bourguignon, L. Y., Peyrollier, K., Xia, W., Gilad, E. Hyaluronan-CD44 interaction activates stem cell marker Nanog, Stat-3-mediated MDR1 gene expression, and ankyrin-regulated multidrug efflux in breast and ovarian tumor cells. Journal of Biological Chemistry. 283 (25), 17635-17651 (2008).
  73. Yin, X., et al. Engineering Stem Cell Organoids. Cell Stem Cell. 18 (1), 25-38 (2016).
  74. Sachs, N., et al. A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
  75. Kim, M., et al. Patient-derived lung cancer organoids as in vitro cancer models for therapeutic screening. Nature Communications. 10 (1), 3991 (2019).
  76. Okano, M., et al. Orthotopic Implantation Achieves Better Engraftment and Faster Growth Than Subcutaneous Implantation in Breast Cancer Patient-Derived Xenografts. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 25 (1), 27-36 (2020).
  77. Zhang, Y., et al. Establishment of a murine breast tumor model by subcutaneous or orthotopic implantation. Oncology Letters. 15 (5), 6233-6240 (2018).
  78. Zhang, W., et al. Comparative Study of Subcutaneous and Orthotopic Mouse Models of Prostate Cancer: Vascular Perfusion, Vasculature Density, Hypoxic Burden and BB2r-Targeting Efficacy. Scientific Reports. 9 (1), 11117 (2019).
  79. Kim, R., Emi, M., Tanabe, K. Cancer immunoediting from immune surveillance to immune escape. Immunology. 121 (1), 1-14 (2007).
  80. Rosato, R. R., et al. Evaluation of anti-PD-1-based therapy against triple-negative breast cancer patient-derived xenograft tumors engrafted in humanized mouse models. Breast Cancer Research. 20 (1), 108 (2018).
  81. Choi, Y., et al. Studying cancer immunotherapy using patient-derived xenografts (PDXs) in humanized mice. Experimental and Molecular Medicine. 50 (8), 99 (2018).
  82. Meraz, I. M., et al. An Improved Patient-Derived Xenograft Humanized Mouse Model for Evaluation of Lung Cancer Immune Responses. Cancer Immunol Res. 7 (8), 1267-1279 (2019).
  83. Wege, A. K. Humanized Mouse Models for the Preclinical Assessment of Cancer Immunotherapy. Biodrugs. 32 (3), 245-266 (2018).

Tags

Breast Cancer Stem CellsCell IsolationSingle Cell SuspensionALDH AssayColony Forming AssayFunctional CharacterizationTumorigenicityMetastasis

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Bhat, V., Lefebvre, C., Goodale, D., Rodriguez-Torres, M., Allan, A. L. Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples. J. Vis. Exp. (164), e61775, doi:10.3791/61775 (2020).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image