開放血管窓と生体内蛍光顕微鏡を用いたマウス蝸牛の心房血流測定
Summary
蛍光トレーサーを使用した開放血管窓アプローチは、人工内耳血流(CoBF)測定に十分な分解能を提供します。この方法は、正常および病理学的条件下でのマウスにおけるCoBFの構造的および機能的変化の研究を容易にする。
Abstract
音の伝達は代謝的に要求が厳しく、側壁の微小血管系の正常な機能は、内視鏡電位、イオン輸送、および体液バランスを維持するために重要です。さまざまな形態の聴覚障害が、蝸牛の異常な微小循環を伴うことが報告されています。人工内耳血流(CoBF)の病理が聴覚機能にどのように影響するかの調査は、実行可能な尋問方法がなく、内耳へのアクセスが困難であるため、困難です。外側蝸牛壁の開いた血管窓は、蛍光生体内顕微鏡と組み合わせて、in vivoでのCoBF変化の研究に使用されてきましたが、主にモルモットで、 ごく最近マウスで使用されてきました。この論文と関連するビデオでは、マウス蝸牛の血流を視覚化するための開放血管窓法について説明しています。詳細には、1)マウス由来の蛍光標識血球懸濁液の調製;2)麻酔マウスにおける生体内顕微鏡観察のための開放血管窓の構築、および3)画像のオフライン記録を使用した血流速度と体積の測定。この方法は、マウスのオープンウィンドウアプローチを使用して、正常および病理学的条件下での蝸牛微小循環の構造的および機能的変化を調べる方法を示すためにビデオ形式で提示されます。
Introduction
外側蝸牛壁(らせん靭帯と脈条血管の毛細血管の大部分を含む)における微小循環の正常な機能は、聴覚機能を維持するために非常に重要です1。異常なCoBFは、騒音性難聴、耳水腫、老人性難聴など、多くの内耳障害の病態生理に関与しています2,3,4,5,6,7,8,9。生体内CoBFの可視化により、聴覚機能と蝸牛血管病理との関連をよりよく理解できるようになります。
側頭骨内の蝸牛の複雑さと位置により、CoBFを直接可視化および測定することはできませんが、レーザードップラー流量測定(LDF)10、11、12、磁気共鳴画像法(MRI)13、蛍光生体内顕微鏡(FIVM)14、蛍光マイクロ内視鏡検査(FME)15、内視鏡レーザースペックルコントラストイメージング(LSCI)16など、CoBFの評価のためのさまざまな方法が開発されています。、および標識マーカーおよび放射性タグ付きミクロスフェアの血流への注入に基づくアプローチ(光学的微小血管造影、OMAG)17,18,19,20。しかし、これらの方法はいずれも、FIVMを除いて、in vivoでのCoBFの変化の絶対的なリアルタイム追跡を可能にしていません。FIVMは、外側蝸牛壁の血管窓と組み合わせて、様々な実験室14、21、22によって異なる実験条件下でモルモットにおいて使用および検証されてきたアプローチである14、21、22。
フルオレセインイソチオシアネート(FITC)-デキストランを造影剤とし、蛍光色素(DiO(3,3′-ジオクタデシルオキサカルボシアニン過塩素酸塩、緑)またはDil(1,1-ジオクタデシル-3,3,3,3-テトラメチルインドカルボシアニン過塩素酸塩、赤)を使用して、マウスの蝸牛微小循環の構造的および機能的変化を研究するためのFIVM法を確立することに成功しました。本研究では、正常および病理学的条件(ノイズ曝露後など)でのマウスにおけるCoBFの変化を画像化および定量化するためのこの方法のプロトコルが記載されている。この技術は、特に容易に入手可能なトランスジェニックマウスモデルと組み合わせて適用された場合、血管線条の聴覚機能障害および病理に関連するCoBFの根底にあるメカニズムを調査するために必要なツールを研究者に提供します。
Protocol
Representative Results
Discussion
この論文は、マウスモデルの蝸牛側壁(および脈理血管)の毛細血管を、FIVMシステム下での開放血管窓調製物における蛍光色素標識でどのように視覚化できるかを示しています。マウスモデルは、ヒトの健康および疾患を調査するための哺乳類モデルとして広く使用され、好ましい。ここで説明するプロトコルは、FIVMシステム下の開いた血管窓を使用して、マウス側壁(特に脈条体)におけるCoBF…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
本研究は、NIH/NIDCD R21 DC016157 (X.Shi)、NIH/NIDCD R01 DC015781 (X.Shi)、NIH/NIDCD R01-DC010844 (X.Shi)、およびオレゴン健康科学大学(OHSU)の医学研究財団(X.Shi)の支援を受けました。
Materials
| 0.9% Sodium Chloride | Hospira | NDC 0409-1966-02 | 0.6 mL (for 1 mL) |
| 1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate | Sigma Aldrich | 468495 | 20 µM |
| 3,3′-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorateDio (3,3′-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate | Sigma Aldrich | D4292 | 20 µM |
| CODA Monitor system | Kent scientific | CODA Monitor, for monitoring blood pressure and heartbeat | |
| Coverslip | Fisher Scientific | 12-542A | |
| DC Temperature Controller | FHC | 40-90-8D | |
| Fiji/ImageJ | NIH | Measurement of vessel diameter | |
| FITC-dextran (2000 kDa) | Sigma Aldrich | FD2000s | 40 mg/mL |
| Heparin Sodium Injection, USP MDV | Mylan | NDC 67457-374-12 | 5000 USP units/mL |
| Katathesia (100 mg/mL) | Henry Schein | NDC 11695-0702-1 | 0.2 mL (for 1 mL) |
| Microscope Objective | Mitutoyo | 378-823-5 | Model: M Plan Apo NIR 10x |
| ORCA-ER Camera | Hamamatsu | Model: C4742-80-12AG | |
| PBS | Gibco | 2085387 | |
| Xyzaine (100 mg/ml, 5x diluted for use ) | Lloyd | LPFL04821 | 0.2 mL (for 1 mL) |
| Zoom Stereo Microscope | Olympus | Model: SZ61, fluorescent microscope |
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