Подход с открытым окном сосудов с использованием флуоресцентных индикаторов обеспечивает достаточное разрешение для измерения кохлеарного кровотока (CoBF). Метод облегчает изучение структурно-функциональных изменений CoBF у мышей при нормальных и патологических состояниях.
Трансдукция звука метаболически требовательна, и нормальная функция микроциркуляторного русла в боковой стенке имеет решающее значение для поддержания эндокохлеарного потенциала, транспорта ионов и баланса жидкости. Сообщается, что различные формы нарушений слуха связаны с аномальной микроциркуляцией в улитке. Исследование того, как патология кохлеарного кровотока (CoBF) влияет на функцию слуха, является сложной задачей из-за отсутствия осуществимых методов опроса и трудностей с доступом к внутреннему уху. Открытое сосудистое окно в боковой кохлеарной стенке в сочетании с флуоресцентной прижизненной микроскопией использовалось для изучения изменений CoBF in vivo, но в основном у морских свинок и только недавно у мыши. В этой статье и связанном с ней видео описывается метод визуализации кровотока в улитке мыши. Детали включают 1) приготовление флуоресцентно меченой суспензии клеток крови от мышей; 2) строительство открытого сосуда-окна для прижизненной микроскопии у анестезируемой мыши и 3) измерение скорости и объема кровотока с помощью автономной записи изображения. Метод представлен в видеоформате, чтобы показать, как использовать подход с открытым окном у мышей для исследования структурных и функциональных изменений в кохлеарной микроциркуляции в нормальных и патологических условиях.
Нормальная функция микроциркуляции в боковой кохлеарной стенке (включающей большинство капилляров в спиральной связке и stria vascularis) критически важна для поддержания слуховой функции1. Аномальный CoBF участвует в патофизиологии многих заболеваний внутреннего уха, включая потерю слуха, вызванную шумом, ушную водянку и пресбикусис 2,3,4,5,6,7,8,9. Визуализация прижизненного CoBF позволит лучше понять связи между функцией слуха и кохлеарной сосудистой патологией.
Хотя сложность и расположение улитки в височной кости исключает прямую визуализацию и измерение CoBF, для оценки CoBF были разработаны различные методы, включая лазерно-допплеровскую флоуметрию (LDF)10,11,12, магнитно-резонансную томографию (МРТ)13, флуоресцентную прижизненную микроскопию (FIVM)14, флуоресцентную микроэндоскопию (FME)15, эндоскопическую лазерную спекл-контрастную визуализацию (LSCI)16 , и подходы, основанные на введении меченых маркеров и радиоактивно меченых микросфер в кровоток (оптическая микроангиография, OMAG)17,18,19,20. Однако ни один из этих методов не позволяет в режиме реального времени отслеживать изменения в CoBF in vivo, за исключением FIVM. FIVM, в сочетании с сосудом-окном в боковой кохлеарной стенке, является подходом, который был использован и проверен на морской свинке в различных экспериментальных условиях различными лабораториями 14,21,22.
Был успешно разработан метод FIVM для изучения структурно-функциональных изменений кохлеарной микроциркуляции у мышей с использованием флуоресцеина изотиоцианата (FITC)-декстрана в качестве контрастного вещества и флуоресцентного красителя – либо DiO (3, 3′-диоктацилоксакарбоцианин перхлорат, зеленый) или Dil (1,1-диоктадецил-3,3,3,3-тетраметилиндокарбоциан перхлорат, красный) – для предварительной маркировки клеток крови, визуализации сосудов и отслеживания скорости кровотока. В настоящем исследовании протокол этого метода был описан для визуализации и количественной оценки изменений CoBF у мышей при нормальных и патологических состояниях (например, после воздействия шума). Этот метод дает исследователю инструменты, необходимые для изучения основных механизмов CoBF, связанных с дисфункцией слуха и патологией в стриях васкулярных мышц, особенно при применении в сочетании с легкодоступными трансгенными моделями мышей.
В данной работе показано, как капилляры в кохлеарной боковой стенке (и в stria vascularis) мышиной модели могут быть визуализированы с помощью флуорофорной маркировки в препарате с открытым сосудом-окном в системе FIVM. Мышиная модель широко используется и предпочтительна в качестве модели млек…
The authors have nothing to disclose.
Это исследование было поддержано NIH / NIDCD R21 DC016157 (X.Shi), NIH / NIDCD R01 DC015781 (X.Shi), NIH / NIDCD R01-DC010844 (X.Shi) и Фондом медицинских исследований из Орегонского университета здоровья и науки (OHSU) (X.Shi).
0.9% Sodium Chloride | Hospira | NDC 0409-1966-02 | 0.6 mL (for 1 mL) |
1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate | Sigma Aldrich | 468495 | 20 µM |
3,3′-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorateDio (3,3′-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate | Sigma Aldrich | D4292 | 20 µM |
CODA Monitor system | Kent scientific | CODA Monitor, for monitoring blood pressure and heartbeat | |
Coverslip | Fisher Scientific | 12-542A | |
DC Temperature Controller | FHC | 40-90-8D | |
Fiji/ImageJ | NIH | Measurement of vessel diameter | |
FITC-dextran (2000 kDa) | Sigma Aldrich | FD2000s | 40 mg/mL |
Heparin Sodium Injection, USP MDV | Mylan | NDC 67457-374-12 | 5000 USP units/mL |
Katathesia (100 mg/mL) | Henry Schein | NDC 11695-0702-1 | 0.2 mL (for 1 mL) |
Microscope Objective | Mitutoyo | 378-823-5 | Model: M Plan Apo NIR 10x |
ORCA-ER Camera | Hamamatsu | Model: C4742-80-12AG | |
PBS | Gibco | 2085387 | |
Xyzaine (100 mg/ml, 5x diluted for use ) | Lloyd | LPFL04821 | 0.2 mL (for 1 mL) |
Zoom Stereo Microscope | Olympus | Model: SZ61, fluorescent microscope |