Cokultur von Axotomized Rat Retinal Ganglion Neurons mit olfactory Ensheathing Glia, als In-Vitro-Modell der erwachsenen axonalen Regeneration
Summary
Wir präsentieren ein In-vitro-Modell zur Beurteilung der olfaktorischen Ensheathing Glia (OEG) neuroregenerativen Kapazität, nach neuronalen Verletzungen. Es basiert auf einer Kokultur von axotomisierten adulten retinalen Ganglion neuronen (RGN) auf OEG-Monolayer und anschließende Studie der axonalen Regeneration, durch die Analyse von RGN axonalen und somatodendritischen Markern.
Abstract
Olfaktorische Ensheathing-Glia-Zellen (OEG) werden von der Riechschleimhaut bis hin zur Riechnervenschicht (ONL) der Riechbirne lokalisiert. Während des gesamten Erwachsenenlebens sind sie der Schlüssel für den axonalen Anbau von neu erzeugten olfaktorischen Neuronen, von der Lamina propria bis zum ONL. Aufgrund ihrer pro-regenerativen Eigenschaften wurden diese Zellen verwendet, um die axonale Regeneration in Rückenmarks- oder Sehnervenverletzungsmodellen zu fördern.
Wir präsentieren ein In-vitro-Modell, um die neuroregenerative OEG-Kapazität nach neuronalen Verletzungen zu assayen und zu messen. In diesem Modell wird reversibel verewigtes menschliches OEG (ihOEG) als Monolayer kultiviert, Netzhaut werden aus erwachsenen Ratten extrahiert und Retinalganglionneuronen (RGN) werden auf die OEG-Monoschicht kokultiviert. Nach 96 h werden axonale und somatodendritische Marker in RGNs durch Immunfluoreszenz analysiert und die Anzahl der RGNs mit Axon und die mittlere axonale Länge/Neuron quantifiziert.
Dieses Protokoll hat den Vorteil gegenüber anderen In-vitro-Assays, die auf embryonalen oder postnatalen Neuronen basieren, dass es die neuroregenerativen OEG-Eigenschaften im erwachsenen Gewebe bewertet. Es ist auch nicht nur nützlich für die Bewertung des neuroregenerativen Potenzials von ihOEG, sondern kann auch auf verschiedene Quellen von OEG oder anderen Gliazellen ausgedehnt werden.
Introduction
Adult Central Nervous System (ZNS) Neuronen haben begrenzte Regenerationsfähigkeit nach Verletzungen oder Krankheiten. Eine gemeinsame Strategie zur Förderung der ZNS-Regeneration ist die Transplantation von Zelltypen an der Verletzungsstelle, die axonales Wachstum induzieren, wie Stammzellen, Schwannzellen, Astrozyten oder olfaktorische Ensheathing-Glia (OEG)-Zellen1,2,3,4,5.
OEG leitet sich vom Neuralkamm6 ab und lokalisiert in der riech-Mukose und in der Riechbirne. Bei Erwachsenen sterben olfaktorische sensorische Neuronen regelmäßig als Folge der Umweltexposition und werden durch neu differenzierte Neuronen ersetzt. OEG umgibt und führt diese neuen olfaktorischen Axone in die Riechbirne und um neue Synapsen mit ihren Zielen in der CNS7zuetablieren. Aufgrund dieser physiologischen Eigenschaften, OEG wurde in Modellen der ZNS-Verletzung wie Rückenmark oder Sehnerv-Verletzung verwendet und seine neuroregenerativen und neuroprotektive Eigenschaften werden bewiesen8,9,10,11. Mehrere Faktoren wurden als verantwortlich für die pro-regenerativen Eigenschaften dieser Zellen identifiziert, einschließlich extrazellulärer Matrixproteasen Produktion oder Sekretion von neurotrophen und axonalen Wachstumsfaktoren12,13,14.
Angesichts der technischen Einschränkungen zur Erweiterung primärer OEG-Zellen haben wir zuvor reversible, unsterblichen humane OEG (ihOEG) Klonlinien etabliert und charakterisiert, die eine unbegrenzte Versorgung mit homogenen OEG bieten. Diese ihOEG-Zellen stammen aus Primärkulturen, die aus olfaktorischen Glühbirnen hergestellt werden, die in Autopsien gewonnen werden. Sie wurden durch Transduktion der telomerase katalytischen Untereinheit (TERT) und des Onkogens Bmi-1 verewigt und mit dem SV40-Virus großes T-Antigen15,16,17,18modifiziert. Zwei dieser ihOEG-Zelllinien sind Ts14, das die Regenerationsfähigkeit der ursprünglichen Kulturen beibehält, und Ts12, eine niedrige regenerative Linie, die in diesen Experimenten als niedrige Regenerationskontrolle verwendet wird18.
Zur Bewertung der OEG-Fähigkeit zur Förderung der axonalen Regeneration nach neuralen Verletzungen wurden mehrere In-vitro-Modelle implementiert. In diesen Modellen wird OEG auf Kulturen unterschiedlicher neuronaler Herkunft angewendet und Neuritenbildung und Dehnung – als Reaktion auf gliaale Kokultur – werden als Assay untersucht. Beispiele für solche neuronalen Quellen sind neonatale Ratte kortikale Neuronen19, Kratzwunden an Ratten embryonalen Neuronen aus kortikalen Gewebedurchgeführt 20, Ratte Netzhautexplante21, Ratte hypothalamische oder hippocampale postnatale Neuronen22,23, postnatale Ratte dorsale Wurzel Ganglion Neuronen24, postnatale Maus kortikospinalen Trakt Neuronen25, menschliche NT2 Neuronen26, oder postnatale zerebrale kortikale Neuronen auf reaktive Astrozyten Narben-ähnliche Kulturen27.
In diesen Modellen beruht der Regenerationstest jedoch auf embryonalen oder postnatalen Neuronen, die eine intrinsische Plastizität aufweisen, die bei verletzten erwachsenen Neuronen fehlt. Um diesen Nachteil zu überwinden, präsentieren wir ein Modell der erwachsenen axonalen Regeneration in Kokulturen von OEG-Linien mit erwachsenen retinalen Ganglionneuronen (RGNs), basierend auf dem ursprünglich von Wigley et al.28,29,30,31 und modifiziert und von unserer Gruppe12,13,14,15,16,17,18,32,33. Kurz gesagt, Netzhautgewebe wird von erwachsenen Ratten extrahiert und mit Papain verdaut. Die Netzhautzellsuspension wird dann entweder auf polylysinbehandelten Abdeckungen oder auf Ts14- und Ts12-Monolayern plattiert. Kulturen werden 96 h lang gepflegt, bevor sie fixiert werden, und dann wird immunfluoreszenz für axonale (MAP1B- und NF-H-Proteine)34 und somatodendritische (MAP2A und B)35 Marker durchgeführt. Die axonale Regeneration wird als Prozentsatz der Neuronen mit Axon quantifiziert, in Bezug auf die Gesamtpopulation der RGNs und der axonale Regenerationsindex wird als mittlere axonale Länge pro Neuron berechnet. Dieses Protokoll ist nicht nur nützlich für die Bewertung des neuroregenerativen Potenzials von ihOEG, sondern kann auch auf verschiedene Quellen von OEG oder anderen Gliazellen ausgedehnt werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
OEG-Transplantation an ZNS-Verletzungsstellen gilt aufgrund ihrer konstitutiven pro-neuroregenerativen Eigenschaften7,8,9als vielversprechende Therapie für ZNS-Verletzungen. Je nach Gewebequelle – Olfaktorische Schleimhaut (OM-OEG) versus Olfaktorinde (OB-OEG) – oder dem Alter des Spenders besteht jedoch eine erhebliche Veränderung in dieser Kapazität26,31,</…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch das Projekt SAF2017-82736-C2-1-R von Ministerio de Ciencia e Innovacién bis MTM-F und durch die Stiftung Universidad Francisco de Vitoria an JS finanziell unterstützt.
Materials
| antibody 514 | Reference 34 | Rabbit polyclonal antiserum, which recognizes MAP2A and B. | |
| antibody SMI-31 | BioLegend | 801601 | Monoclonal antibody against MAP1B and NF-H proteins |
| anti-mouse Alexa Fluor 488 antibody | ThermoFisher | A-21202 | |
| anti-rabbit Alexa Fluor 594 antibody | ThermoFisher | A-21207 | |
| B-27 Supplement | Gibco | 17504044 | |
| D,L-2-amino-5-phosphonovaleric acid | Sigma | 283967 | NMDA receptor inhibitor |
| DAPI | Sigma | D9542 | Nuclei fluorescent stain |
| DMEM-F12 | Gibco | 11320033 | Cell culture medium |
| FBS | Gibco | 11573397 | Fetal bovine serum |
| FBS-Hyclone | Fisher Scientific | 16291082 | Fetal bovine serum |
| Fluoromount | Southern Biotech | 0100-01 | Mounting medium |
| ImageJ | National Institutes of Health (NIH-USA) | Image software | |
| L-Glutamine | Lonza | BE17-605F | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | Neuronal cells culture medium |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corporation | LK003150 | For use in neural cell isolation |
| PBS | Home made | ||
| PBS-EDTA | Lonza | H3BE02-017F | |
| Penicillin/Streptomycin/Amphotericin B | Lonza | 17-745E | Bacteriostatic and bactericidal |
| Pituitary extract | Gibco | 13028014 | Bovine pituitary extract |
| Poly -L- lysine (PLL) | Sigma | A-003-M |
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