वयस्क अक्षीय उत्थान के इन विट्रो मॉडल के रूप में, घ्राण एनशेथिंग ग्लिया के साथ एक्सोटॉमीड चूहा रेटिना गैंगलियन न्यूरॉन्स की कूकल्चर
Summary
हम तंत्रिका चोट के बाद घ्राण ensheathing ग्लिया (OEG) न्यूरोरेगेरेटिव क्षमता का आकलन करने के लिए एक इन विट्रो मॉडल प्रस्तुत करते हैं। यह आरजीएन एक्सोनल और सोमाटोडेन्ड्रिटिक मार्कर का विश्लेषण करके, ओईजी मोनोलेयर्स पर एक्सोटॉमीड वयस्क रेटिना गैंगलियन न्यूरॉन्स (आरजीएन) और अक्षीय उत्थान के बाद के अध्ययन की एक सहसंस्कृति पर आधारित है।
Abstract
घ्राण ensheathing ग्लिया (OEG) कोशिकाओं को घ्राण म्यूकोसा से और घ्राण बल्ब के घ्राण तंत्रिका परत (ओएनएल) में सभी तरह से स्थानीयकृत किया जाता है। वयस्क जीवन के दौरान, वे नए उत्पन्न घ्राण न्यूरॉन्स के अक्षांक बढ़ने के लिए महत्वपूर्ण हैं, लैमिना प्रोप्रिया से ओएनएल तक। उनके समर्थक पुनर्योजी गुणों के कारण, इन कोशिकाओं को रीढ़ की हड्डी या ऑप्टिक तंत्रिका चोट मॉडल में अक्षीय उत्थान को बढ़ावा देने के लिए इस्तेमाल किया गया है ।
हम तंत्रिका चोट के बाद OEG न्यूरोरेगेरेटिव क्षमता को परखने और मापने के लिए एक इन विट्रो मॉडल पेश करते हैं। इस मॉडल में, रिवर्सिबली रूप से अमर मानव ओईजी (आईएचओईजी) को मोनोलेयर के रूप में सुसंस्कृत किया जाता है, रेटिना वयस्क चूहों से निकाले जाते हैं और रेटिना गैंगलियन न्यूरॉन्स (आरजीएन) को ओईजी मोनोलेयर पर सहसंस्कृत किया जाता है। 96 घंटे के बाद, आरजीएन में अक्षीय और सोमाटोडेन्ड्रिटिक मार्कर का विश्लेषण इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा किया जाता है और एक्सॉन के साथ आरजीएन की संख्या और मतलब एक्सोनल लंबाई/न्यूरॉन की मात्रा निर्धारित की जाती है।
इस प्रोटोकॉल में अन्य इन विट्रो परख पर लाभ है जो भ्रूण या प्रसवोत्तर न्यूरॉन्स पर भरोसा करते हैं, कि यह वयस्क ऊतक में ओईजी न्यूरोरेजेनेरेटिव गुणों का मूल्यांकन करता है। इसके अलावा, यह न केवल आईएचओईजी की न्यूरोरेगेरेटिव क्षमता का आकलन करने के लिए उपयोगी है बल्कि इसे ओईजी या अन्य ग्लियल कोशिकाओं के विभिन्न स्रोतों तक बढ़ाया जा सकता है।
Introduction
वयस्क केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) न्यूरॉन्स चोट या रोग के बाद सीमित पुनर्योजी क्षमता है। सीएनएस पुनर्जनन को बढ़ावा देने के लिए एक आम रणनीति, चोट स्थल पर प्रत्यारोपण, सेल प्रकारों की है जो स्टेम सेल, श्वान कोशिकाओं, एस्ट्रोसाइट्स या घ्राण ensheathing ग्लिया (OEG) कोशिकाओं1,2,3,4,5जैसे अक्षीय विकास को प्रेरित करतीहै।
ओईजी तंत्रिका क्रेस्ट6 से निकला है और घ्राण म्यूकोसा में और घ्राण बल्ब में ढूंढता है। वयस्क में, घ्राण संवेदी न्यूरॉन्स पर्यावरण जोखिम के परिणामस्वरूप नियमित रूप से मर जाते हैं और उन्हें नए विभेदित न्यूरॉन्स द्वारा प्रतिस्थापित किया जाता है। ओईजी इन नए घ्राण अक्षों को घ्राण बल्ब में प्रवेश करने और सीएनएस 7 में अपने लक्ष्यों के साथ नए सिनेप्सस्थापितकरने के लिए घेर लेता है और मार्गदर्शन करताहै । इन शारीरिक विशेषताओं के कारण, ओईजी का उपयोग सीएनएस चोट जैसे रीढ़ की हड्डी या ऑप्टिक तंत्रिका चोट के मॉडलों में किया गया है और इसके न्यूरोरेग्नेटिव और न्यूरोप्रोटेक्टिव गुण सिद्ध हो जाते हैं8,9,10, 11। इन कोशिकाओं की प्रो-पुनर्योजी विशेषताओं के जिम्मेदार कई कारकों के रूप में पहचान की गई है, जिनमें एक्सेल्युलर मैट्रिक्स प्रोटेसिस उत्पादन या न्यूरोट्रोफिक और एक्सोनल विकास कारकों का स्राव12,13,14शामिल है।
प्राथमिक ओईजी कोशिकाओं का विस्तार करने के लिए तकनीकी सीमाओं को देखते हुए, हमने पहले रिवर्सिबल अमर मानव ओईजी (ihOEG) क्लोनल लाइनों की स्थापना की और विशेषता बनाई, जो सजातीय ओईजी की असीमित आपूर्ति प्रदान करती है। ये ihOEG कोशिकाएं प्राथमिक संस्कृतियों से प्राप्त होती हैं, जो ऑटोप्सी में प्राप्त घ्राण बल्बों से तैयार होती हैं। उन्हें टेलोमेरेस उत्प्रेरक उपइकाइट (टीईआरटी) और ओन्कोजीन बीएमआई-1 के लेनदेन से अमर किया गया था और एसवी 40वायरस बड़े टी एंटीजन15, 16,17,18के साथ संशोधित किया गया था। इनमें से दो ihOEG सेल लाइनें Ts14 हैं, जो मूल संस्कृतियों और Ts12 की पुनर्योजी क्षमता को बनाए रखती हैं, एक कम पुनर्योजी रेखा जिसका उपयोग इन प्रयोगों में कम पुनर्जनन नियंत्रण के रूप में किया जाता है18।
तंत्रिका चोट के बाद अक्षीय उत्थान को बढ़ावा देने के लिए OEG क्षमता का आकलन करने के लिए, कई इन विट्रो मॉडल लागू किए गए हैं । इन मॉडलों में, ओईजी को विभिन्न न्यूरोनल मूल और न्यूराइट गठन और विस्तार की संस्कृतियों पर लागू किया जाता है- ग्लियल कोकल्चर के जवाब में- परख लिया जाता है। इस तरह के न्यूरोनल स्रोतों के उदाहरण नवजात चूहा कॉर्टिकल न्यूरॉन्स19,कॉर्टिकल ऊतक20से चूहे भ्रूण न्यूरॉन्स पर किए गए खरोंच घाव, चूहे रेटिना एक्सप्लांट21,चूहा हाइपोथैलेमिक या हिप्पोकैम्पल पोस्टनेटल न्यूरॉन्स22,23, पोस्टनेटल रैट डॉरसल रूट गैंगलियन न्यूरॉन्स24, प्रसवोत्तर माउस कॉर्टिकोस्पाइनल ट्रैक्ट न्यूरॉन्स25,ह्यूमन एनटी2 न्यूरॉन्स26,या पोस्टनेटल सेरेब्रल कॉर्टिकल न्यूरॉन्स पर प्रतिक्रियाशील एस्ट्रोसाइट निशान जैसी संस्कृतियों पर27।
इन मॉडलों में, हालांकि, उत्थान परख भ्रूण या प्रसवोत्तर न्यूरॉन्स पर निर्भर करती है, जिसमें एक आंतरिक प्लास्टिसिटी होती है जो घायल वयस्क न्यूरॉन्स में अनुपस्थित होती है। इस खामी को दूर करने के लिए, हम वयस्क रेटिना गैंगलियन न्यूरॉन्स (आरजीएन) के साथ ओईजी लाइनों की सहसंस्कृतियों में वयस्क अक्षीय उत्थान का एक मॉडल प्रस्तुत करते हैं, जो मूल रूप से विग्ले एट अल द्वारा विकसित किया गयाहै।28, 29,30,31 और संशोधित और हमारे समूह द्वारा उपयोग12,13,14,15,16,17,18,32 ,33 संक्षेप में, रेटिना ऊतक वयस्क चूहों से निकाला जाता है और पापीन के साथ पचा जाता है। रेटिना सेल निलंबन तो या तो पॉलीसाइन-इलाज कवरस्लिप पर या Ts14 और Ts12 मोनोलेयर्स पर चढ़ाया जाता है । संस्कृतियों को तय करने से पहले ९६ घंटे के लिए बनाए रखा जाता है और फिर अक्षांश (MAP1B और एनएफ-एच प्रोटीन)३४ और सोमाटोडेन्ड्रिटिक (MAP2A और B)३५ मार्कर के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस किया जाता है । एक्सोनल पुनर्जनन को एक्सॉन के साथ न्यूरॉन्स के प्रतिशत के रूप में निर्धारित किया जाता है, आरजीएन की कुल आबादी के संबंध में और अक्षारक पुनर्जनन सूचकांक की गणना प्रति न्यूरॉन औसत अक्षाणल लंबाई के रूप में की जाती है। यह प्रोटोकॉल न केवल आईएचओईजी की न्यूरोरेगेरेटिव क्षमता का आकलन करने के लिए उपयोगी है बल्कि इसे ओईजी या अन्य ग्लियल कोशिकाओं के विभिन्न स्रोतों तक बढ़ाया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
सीएनएस चोट स्थलों पर ओईजी प्रत्यारोपण सीएनएस चोट के लिए एक आशाजनक चिकित्सा माना जाता है क्योंकि इसके संविलियन प्रो-न्यूरोरेजेनेरेटिव गुण7,8,9हैं। हालांकि, ऊतक स्रोत…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को परियोजना SAF2017-82736-C2-1-R से मिनिस्टरियो डी सिन्सिया ई इनोवासिओन से एमटीएम-एफ और फंडासिओन यूनीवर्सिडो फ्रांसिस्को डी विटोरिया द्वारा जेएस को आर्थिक रूप से समर्थित किया गया था।
Materials
| antibody 514 | Reference 34 | Rabbit polyclonal antiserum, which recognizes MAP2A and B. | |
| antibody SMI-31 | BioLegend | 801601 | Monoclonal antibody against MAP1B and NF-H proteins |
| anti-mouse Alexa Fluor 488 antibody | ThermoFisher | A-21202 | |
| anti-rabbit Alexa Fluor 594 antibody | ThermoFisher | A-21207 | |
| B-27 Supplement | Gibco | 17504044 | |
| D,L-2-amino-5-phosphonovaleric acid | Sigma | 283967 | NMDA receptor inhibitor |
| DAPI | Sigma | D9542 | Nuclei fluorescent stain |
| DMEM-F12 | Gibco | 11320033 | Cell culture medium |
| FBS | Gibco | 11573397 | Fetal bovine serum |
| FBS-Hyclone | Fisher Scientific | 16291082 | Fetal bovine serum |
| Fluoromount | Southern Biotech | 0100-01 | Mounting medium |
| ImageJ | National Institutes of Health (NIH-USA) | Image software | |
| L-Glutamine | Lonza | BE17-605F | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | Neuronal cells culture medium |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corporation | LK003150 | For use in neural cell isolation |
| PBS | Home made | ||
| PBS-EDTA | Lonza | H3BE02-017F | |
| Penicillin/Streptomycin/Amphotericin B | Lonza | 17-745E | Bacteriostatic and bactericidal |
| Pituitary extract | Gibco | 13028014 | Bovine pituitary extract |
| Poly -L- lysine (PLL) | Sigma | A-003-M |
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