הליכים השתלת מח עצם בעכברים ללמוד Hematopoiesis שיבוט
Summary
אנו מתארים שלוש שיטות של השתלת מח עצם (BMT): BMT עם הקרנת גוף כוללת, BMT עם הקרנה מוגנת, ושיטת BMT ללא מיזוג מראש (BMT מאמץ) לחקר המטופוזיס שיבוטים במודלים של עכבר.
Abstract
המטופויזיס קלונל הוא מצב נפוץ הקשור לגיל הנובע מהצטברות של מוטציות סומטיות בתאי גזע ו אבות מהמטופויטיים (HSPCs). מוטציות בגנים של הנהג, המעניקות כושר תאי, יכולות להוביל להתפתחות של שיבוטי HSPC מתרחבים שגורמים יותר ויותר לויקוציטים צאצאים המעניקים מחסה למוטציה הסומטית. מכיוון שהמטופוזיס שיבוטי נקשר למחלות לב, שבץ ותמותה, פיתוח מערכות ניסיוניות המרכיבות תהליכים אלה הוא המפתח להבנת המנגנונים העומדים בבסיס גורם סיכון חדש זה. הליכים השתלת מח עצם מעורבים מיזוג מיאלובלטיבי בעכברים, כגון הקרנת הגוף הכולל (TBI), משמשים בדרך כלל כדי ללמוד את התפקיד של תאים חיסוניים במחלות לב וכלי דם. עם זאת, נזק בו זמנית לגומחת מח העצם ולאתרים מעניינים אחרים, כגון הלב והמוח, הוא בלתי נמנע עם הליכים אלה. לכן, המעבדה שלנו פיתחה שתי שיטות חלופיות כדי למזער או למנוע תופעות לוואי אפשריות הנגרמות על ידי TBI: 1) השתלת מח עצם עם מיגון הקרנה ו 2) BMT מאמץ לעכברים לא מותנים. באיברים מוגנים, הסביבה המקומית נשמרת ומאפשרת ניתוח של hematopoiesis שיבוט בעוד הפונקציה של תאים חיסוניים תושב הוא ללא הפרעה. לעומת זאת, BMT מאמץ לעכברים לא מותנים יש יתרון נוסף כי הן את הסביבות המקומיות של האיברים ואת הנישה hematopoietic נשמרים. כאן, אנו משווים שלוש גישות שונות של שחזור תאים hematopoietic ולדון החוזקות והמגבלות שלהם למחקרים של hematopoiesis שיבוט במחלות לב וכלי דם.
Introduction
המטופוזיס שיבוט (CH) הוא מצב אשר נצפתה לעתים קרובות אצל אנשים קשישים מתרחשת כתוצאה של גזע hematopoietic מורחב תא אב (HSPC) שיבוט נושא מוטציהגנטית 1. הוצע כי עד גיל 50, רוב האנשים ירכשו בממוצע חמש מוטציות אקסוניק בכל HSPC2, אבל רוב המוטציות האלה יגרמו לתוצאות פנוטיפיות מועטות או לא לא לאדם. עם זאת, אם במקרה אחת מהמוטציות הללו מעניקה יתרון תחרותי ל- HSPC – למשל על-ידי קידום התפשטותו, חידושו העצמי, הישרדותו או שילוב כלשהו שלו – הדבר עשוי להוביל להרחבה מועדפת של שיבוט המוטנטים ביחס ל- HSPCs האחרים. כתוצאה מכך, המוטציה תתפשט יותר ויותר דרך מערכת hematopoietic כמו HSPC מוטציה מעוררת תאי דם בוגרים, המוביל לאוכלוסייה ברורה של תאים שעברו מוטציה בתוך הדם ההיקפי. בעוד מוטציות בעשרות גנים שונים של נהג מועמד קושרו עם אירועי שיבוט בתוך מערכת hematopoietic, בין אלה, מוטציות ב- DNA מתיל טרנספראז 3 אלפא (DNMT3A) ועשרה טרנסלוקציה 11 2 (TET2) הם הנפוצים ביותר3. מספר מחקרים אפידמיולוגיים מצאו כי אנשים הנושאים מוטציות גנטיות אלה יש סיכון גבוה יותר באופן משמעותי למחלות לב וכלי דם (CVD), שבץ, ותמותה סיבתית3,4,5,6,7. בעוד שמחקרים אלה זיהו כי קיים קשר בין CH לבין שכיחות מוגברת של CVD ושבץ, איננו יודעים אם קשר זה הוא סיבתי או אפיפנומנון משותף עם תהליך ההזדקנות. כדי לקבל הבנה טובה יותר של קשר זה, מודלים בעלי חיים נאותים כי נכון לסכם את המצב האנושי של CH נדרשים.
מספר מודלים של בעלי חיים CH הוקמו על ידי הקבוצה שלנו ואחרים באמצעות זברה, עכברים, פרימטים שאינם אנושיים8,9,10,11,12,13,14. מודלים אלה משתמשים לעתים קרובות בשיטות שחזור hematopoietic על ידי השתלת תאים מהונדסים גנטית, לפעמים באמצעות Recombination Cre-lox או מערכת CRISPR. גישה זו מאפשרת ניתוח של מוטציה גנטית ספציפית בתאים hematopoietic כדי להעריך איך זה תורם להתפתחות המחלה. בנוסף, מודלים אלה מעסיקים לעתים קרובות תאים קוגניים או תאים כתב כדי להבחין בין ההשפעות של תאים מוטנטים מתאים נורמליים או פראיים. במקרים רבים, משטר טרום מיזוג נדרש בהצלחה לחרוט תאי גזע hematopoietic התורם.
נכון לעכשיו, השתלת מח עצם לעכברים המטופל ניתן לחלק לשתי קטגוריות עיקריות: 1) מיזוג מיאלובלטיבי 2) השתלה מותנית. מיזוג Myeloablative יכול להיות מושגת על ידי אחת משתי שיטות, כלומר, הקרנת הגוף הכולל (TBI) אוכימותרפיה 15. TBI מתבצעת על ידי החשפות הנמען למנה קטלנית של הקרנת גמא או רנטגן, יצירת הפסקות DNA או קישורים צולבים בתוך תאים המפרידים במהירות, מה שהפך אותם לבלתי הפיכים16. בוסולפן וציקלופוזפיד הן שתי תרופות כימותרפיות נפוצות המשבשות את הנישה ההמטופוביטית וגורמות באופן דומה לנזק לדנ”א לתאים המפרידים במהירות. התוצאה נטו של תנאי מקדים מיאלובלטיבי הוא אפופטוזיס של תאים hematopoietic, אשר הורס את המערכת hematopoietic של המטופל. אסטרטגיה זו לא רק מאפשרת חריטה מוצלחת של HSPCs התורם, אבל יכול גם למנוע דחיית השתל על ידי דיכוי המערכת החיסונית של המטופל. עם זאת, myeloablative תנאי מוקדם יש תופעות לוואי חמורות כגון נזק לרקמות ואיברים ותאי החיסון תושב שלהם, כמו גם הרס של נישה מח עצם יליד17. לכן, הוצעו שיטות חלופיות להתגבר על תופעות לוואי לא רצויות אלה, במיוחד לגבי נזק לאיברים בעלי עניין. שיטות אלה כוללות הקרנה מוגנת של עכברים נמענים ואת BMT מאמץ לעכברים לא מותנים9,17. הגנה על בית החזה, חלל הבטן, הראש או אזורים אחרים מפני הקרנה על ידי מיקום של מחסומי עופרת שומרת על רקמות מעניינות מוגנות מפני ההשפעות המזיקות של הקרנה ושומרת על אוכלוסיית תאי החיסון התושבים שלהם. מצד שני, BMT מאמץ של HSPCs לעכברים מותנים יש יתרון נוסף כי זה משמר את הנישה hematopoietic יליד. בכתב יד זה, אנו מתארים את הפרוטוקולים והתוצאות של תחריט HSPC לאחר מספר משטרי השתלה בעכברים, במיוחד מסירת HSPC לעכברי TBI, לעכברים המוגנים חלקית מפני הקרנה, ולעכברים לא מותנים. המטרה הכוללת היא לעזור לחוקרים להבין את ההשפעות הפיזיולוגיות השונות של כל שיטה, כמו גם כיצד הם משפיעים על תוצאות ניסיוניות בהגדרה של CH ומחלות לב וכלי דם.
Protocol
Representative Results
Discussion
במחקרים על hematopoiesis שיבוט, תיארנו שלוש שיטות של BMT: BMT עם הקרנה גוף כולל, BMT עם הקרנה עם מיגון חלקי, ושיטת BMT פחות נפוץ שאינו כרוך מיזוג מראש (BMT מאמץ). שיטות אלה שימשו כדי להעריך את ההשפעה של hematopoiesis שיבוט על מחלות לב וכלי דם. חוקרים יכולים לשנות שיטות אלה בהתאם כדי להתאים למטרה הספציפית של המחקר ש…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות בארה”ב מענקים K. וולש (HL131006, HL138014, ו HL132564), כדי ס סנו (HL152174), איגוד הלב האמריקאי להעניק M. A. אוונס (20POST35210098), ומענק קרן הלב יפן H. Ogawa.
Materials
| 0.5ml microcentrifuge | Fisher Scientific | 05-408-121 | general supply |
| 1.5ml microcentrifuge | Fisher Scientific | 05-408-129 | general supply |
| 1/2 cc LO-DOSE INSULIN SYRINGE | EXELINT | 26028 | general supply |
| Absolute Ethanol (200 prfof) | Fisher chemical | 200559 | general supply |
| BD 1mL Tuberculin Syringes 25G 5/8 Inch Needle | Becton Dickinson | 309626 | general supply |
| BD PrecisionGlide Needle 18G (1.22mm X 25mm) | Becton Dickinson | 395195 | general supply |
| Cesium-137 Irradiator | J. L. Shepherd | Mark IV | equipment |
| DietGel 76A | Clear H2O | 70-01-5022 | general supply |
| Falcon 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish | Life Sciences | 353003 | general supply |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 352098 | general supply |
| Fisherbrand sterile cell strainers, 70 μm | Fisher Scientific | 22363548 | general supply |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | general supply |
| Hardened Fine Scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | general supply |
| Isothesia (Isoflurane) solution | Henry Schein | 29404 | Solution |
| Ketamine | Zoetis | 043-304 | injection |
| Kimwipes Delicate Task Wipers | Kimtech Science | KCC34155 | general supply |
| PBS pH7.4 (1X) | Gibco | 10010023 | Solution |
| RadDisk – Rodent Irradiator Disk | Braintree Scientific | IRD-P M | general supply |
| RPMI Medium 1640 (1X) | Gibco | 11875-093 | Medium |
| Sulfamethoxazole and Trimethoprim | TEVA | 0703-9526-01 | injection |
| Xylazine | Akorn | 139-236 | injection |
| X-ray irradiator | Rad source | RS-2000 | equipment |
References
- Evans, M. A., Sano, S., Walsh, K. Cardiovascular disease, aging, and clonal hematopoiesis. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 15 (1), 419-438 (2020).
- Welch, J. S., et al. The origin and evolution of mutations in acute myeloid leukemia. Cell. 150 (2), 264-278 (2012).
- Jaiswal, S., et al. Age-related clonal hematopoiesis associated with adverse outcomes. New England Journal of Medicine. 371 (26), 2488-2498 (2014).
- Dorsheimer, L., et al. Association of mutations contributing to conal hematopoiesis with prognosis in chronic ischemic heart failure. JAMA Cardiology. 4 (1), 25 (2019).
- Genovese, G., et al. Clonal hematopoiesis and blood-cancer risk inferred from blood DNA sequence. New England Journal of Medicine. 371 (26), 2477-2487 (2014).
- Jaiswal, S., et al. Clonal hematopoiesis and risk of atherosclerotic cardiovascular disease. New England Journal of Medicine. 377 (2), 111-121 (2017).
- Bick, A. G., et al. Genetic interleukin 6 signaling deficiency attenuates cardiovascular risk in clonal hematopoiesis. Circulation. 141 (2), 124-131 (2020).
- Fuster, J. J., et al. Clonal hematopoiesis associated with TET2 deficiency accelerates atherosclerosis development in mice. Science. 355 (6327), 842-847 (2017).
- Wang, Y., et al. Tet2-mediated clonal hematopoiesis in nonconditioned mice accelerates age-associated cardiac dysfunction. JCI Insight. 5 (6), 135204 (2020).
- Sano, S., et al. Tet2-mediated clonal hematopoiesis accelerates heart failure through a mechanism involving the IL-1β/NLRP3 inflammasome. Journal of the American College of Cardiology. 71 (8), 875-886 (2018).
- Sano, S., et al. JAK2-mediated clonal hematopoiesis accelerates pathological remodeling in murine heart failure. JACC: Basic to Translational Science. 4 (6), 684-697 (2019).
- Yu, K. R., et al. The impact of aging on primate hematopoiesis as interrogated by clonal tracking. Blood. 131 (11), 1195-1205 (2018).
- Sano, S., et al. CRISPR-mediated gene editing to assess the roles of Tet2 and Dnmt3a in clonal hematopoiesis and cardiovascular disease. Circulation Research. 123 (3), 335-341 (2018).
- Stachura, D. L., et al. Clonal analysis of hematopoietic progenitor cells in the zebrafish. Blood. 118 (5), 1274-1282 (2011).
- Gyurkocza, B., Sandmaier, B. M. Conditioning regimens for hematopoietic cell transplantation: one size does not fit all. Blood. 124 (3), 344-353 (2014).
- Bacigalupo, A., et al. Defining the intensity of conditioning regimens: working definitions. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 15 (12), 1628-1633 (2009).
- Abbuehl, J. P., Tatarova, Z., Held, W., Huelsken, J. Long-term engraftment of primary bone marrow stromal cells repairs niche damage and improves hematopoietic stem cell transplantation. Cell Stem Cell. 21 (2), 241-255 (2017).
- Shao, L., et al. Total body irradiation causes long-term mouse BM injury via induction of HSC premature senescence in an Ink4a- and Arf-independent manner. Blood. 123 (20), 3105-3115 (2014).
- Cui, Y. Z., et al. Optimal protocol for total body irradiation for allogeneic bone marrow transplantation in mice. Bone Marrow Transplantation. 30 (12), 843-849 (2002).
- Koch, A., et al. Establishment of early endpoints in mouse total-body irradiation model. PLOS One. 11 (8), 0161079 (2016).
- Ismaiel, A., Dumitraşcu, D. L. Cardiovascular risk in fatty liver disease: the liver-heart axis-literature review. Frontiers in Medicine. 6, 202 (2019).
- Amann, K., Wanner, C., Ritz, E. Cross-talk between the kidney and the cardiovascular system. Journal of the American Society of Nephrology. 17 (8), 2112-2119 (2006).
- Liao, X., et al. Distinct roles of resident and nonresident macrophages in nonischemic cardiomyopathy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (20), 4661-4669 (2018).
- Honold, L., Nahrendorf, M. Resident and monocyte-derived macrophages in cardiovascular disease. Circulation Research. 122 (1), 113-127 (2018).
- Lavine, K. J., et al. The macrophage in cardiac homeostasis and disease. Journal of the American College of Cardiology. 72 (18), 2213-2230 (2018).
- Ginhoux, F., Guilliams, M. Tissue-resident macrophage ontogeny and homeostasis. Immunity. 44 (3), 439-449 (2016).
- Mildner, A., et al. Microglia in the adult brain arise from Ly-6C hi CCR2+ monocytes only under defined host conditions. Nature Neuroscience. 10 (12), 1544-1553 (2007).
- Cronk, J. C., et al. Peripherally derived macrophages can engraft the brain independent of irradiation and maintain an identity distinct from microglia. Journal of Experimental Medicine. 215 (6), 1627-1647 (2018).
- Lu, R., Czechowicz, A., Seita, J., Jiang, D., Weissman, I. L. Clonal-level lineage commitment pathways of hematopoietic stem cells in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (4), 1447-1456 (2019).
- Gibson, B. W., et al. Comparison of cesium-137 and X-ray irradiators by using bone marrow transplant reconstitution in C57BL/6J mice. Comparative Medicine. 65 (3), 165-172 (2015).
- Cui, Y. Z., et al. Optimal protocol for total body irradiation for allogeneic bone marrow transplantation in mice. Bone Marrow Transplantation. 30 (12), 843-849 (2002).
- Kim, C. K., Yang, V. W., Bialkowska, A. B. The role of intestinal stem cells in epithelial regeneration following radiation-induced gut injury. Current Stem Cell Reports. 3 (4), 320-332 (2017).
