小鼠骨髓移植程序研究克隆造血症
Summary
我们描述了三种骨髓移植方法（BMT）：全身辐照的BMT、屏蔽辐照的BMT和无预调理（采用BMT）的BMT方法，用于研究小鼠模型中的克隆造血。
Abstract
克隆造血是一种普遍的年龄相关疾病，是造血干细胞和祖细胞（HSPCs）体细胞突变积累的结果。驱动基因的突变，赋予细胞的适应性，可以导致扩大HSPC克隆的发展，越来越多地导致后代白细胞怀有体细胞突变。由于克隆造血症与心脏病、中风和死亡率有关，因此开发模拟这些过程的实验系统是理解这一新危险因素的机制的关键。骨髓移植程序涉及小鼠骨髓移植调节，如全身照射（TBI），通常用于研究免疫细胞在心血管疾病中的作用。然而，同时损害骨髓利基和其他感兴趣的部位，如心脏和大脑，是不可避免的与这些程序。因此，我们的实验室已经开发出两种替代方法，以尽量减少或避免TBI可能造成的副作用：1） 骨髓移植与辐照屏蔽和 2） 采用BMT到非条件小鼠。在屏蔽器官中，保留局部环境，以便分析克隆造血，同时居民免疫细胞的功能不受干扰。相比之下，对无条件小鼠采用BMT具有额外的优势，即保留器官的局部环境和造血利基。在这里，我们比较了三种不同的造血细胞重组方法，并讨论了它们在心血管疾病中克隆造血症研究的长处和局限性。
Introduction
克隆造血症 （CH） 是一种在老年人中经常观察到的疾病，并且由于携带基因突变1的扩大造血干细胞和祖细胞 （HSPC） 克隆而发生。有人建议，到50岁时，大多数个体在每一个HSPC2中平均会获得5个外向突变，但大多数这些突变对个体的影响很小或根本没有。然而，如果这些突变中偶然的一个给HSPC带来竞争优势，例如通过促进它的增殖、自我更新、生存或这些突变的某种组合——这可能导致突变克隆相对于其他HSC的优先扩展。因此，随着突变的HSPC产生成熟的血细胞，突变将越来越多地通过造血系统传播，导致周围血液中突变细胞的明显数量。虽然数十种不同候选驱动基因的突变与造血系统中的克隆事件有关，但其中，DNA甲基转移酶3α（DNMT3A）和11个转移2（TET2）的突变是最普遍的3。一些流行病学研究发现，携带这些基因突变的个体患心血管疾病（CVD）、中风和全因死亡率的风险要高得多。虽然这些研究已经确定CH与心乳炎和中风发病率增加之间存在关联，但我们不知道这种关系是因果关系还是与衰老过程共享的表皮。为了更好地了解这种关联，需要适当的动物模型来正确地回顾CH的人类状况。
我们小组和其他使用斑马鱼、老鼠和非人类灵长类动物8、9、10、11、12、13、14建立了若干CH动物模型。这些模型通常使用造血重组方法移植转基因细胞，有时使用Cre-lox重组或CRISPR系统。这种方法允许分析造血细胞中的特定基因突变，以评估它如何促进疾病发展。此外，这些模型通常使用致癌细胞或报告细胞来区分突变细胞与正常或野生细胞的影响。在许多情况下，需要预调理方案才能成功移植供体造血干细胞。
目前，骨髓移植到受体小鼠可分为两大类：1）骨髓移植和2）无条件移植。骨髓调节可以通过两种方法之一，即全身照射（TBI）或化疗15实现。TBI是通过让接受者接受致命剂量的伽马或X射线照射，在快速分裂的细胞内产生DNA断裂或交叉链接，使它们无法弥补16。布苏尔凡和环磷酰胺是两种常用的化疗药物，它们破坏造血利基，并同样对快速分裂的细胞造成DNA损伤。骨髓疏松预制的最终结果是造血细胞凋亡，从而破坏了受体的造血系统。这一战略不仅使捐赠者HSPC能够成功获得，而且可以通过抑制接受者的免疫系统来防止移植排斥。然而，骨髓调节有严重的副作用，如损害组织和器官及其居民免疫细胞，以及破坏原生骨髓利基17。因此，提出了克服这些不良副作用的替代方法，特别是在对利益机关的损害方面。这些方法包括受体小鼠的屏蔽辐照和采用BMT对非条件小鼠9，17。通过放置铅屏障保护胸腔、腹腔、头部或其他区域免受辐照，使感兴趣的组织免受辐照的破坏性影响，并维持其常驻免疫细胞群。另一方面，HSPC对无条件小鼠的采用BMT具有额外的优势，因为它保留了原生的造血利基。在本手稿中，我们描述了在小鼠中移植几种方案后HSPC移植的协议和结果，特别是将HSPC输送给TBI小鼠、部分不受辐照的老鼠和非条件小鼠。总体目标是帮助研究人员了解每种方法的不同生理影响，以及它们如何影响CH和心血管疾病设置中的实验结果。
Protocol
Representative Results
Discussion
对于克隆造血症的研究，我们描述了BMT的三种方法：具有全身辐照的BMT、带部分屏蔽的辐照BMT，以及一种不太常用的BMT方法，不涉及预调理（采用BMT）。这些方法已用于评估克隆血吸管对心血管疾病的影响。研究人员可以相应地修改这些方法，以适应他们研究的具体目的。
克隆造血模型
克隆造血是突变造血细胞与野生类型细胞竞争并随着时间的推移获得克隆?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了美国国家卫生研究院对K.Walsh（HL131006，HL138014和HL132564）的资助，对S.Sano（HL152174）、美国心脏协会对M.A.Evans（20POST35210098）的赠款以及日本心脏基金会对小川的赠款的支持。
Materials
| 0.5ml microcentrifuge | Fisher Scientific | 05-408-121 | general supply |
| 1.5ml microcentrifuge | Fisher Scientific | 05-408-129 | general supply |
| 1/2 cc LO-DOSE INSULIN SYRINGE | EXELINT | 26028 | general supply |
| Absolute Ethanol (200 prfof) | Fisher chemical | 200559 | general supply |
| BD 1mL Tuberculin Syringes 25G 5/8 Inch Needle | Becton Dickinson | 309626 | general supply |
| BD PrecisionGlide Needle 18G (1.22mm X 25mm) | Becton Dickinson | 395195 | general supply |
| Cesium-137 Irradiator | J. L. Shepherd | Mark IV | equipment |
| DietGel 76A | Clear H2O | 70-01-5022 | general supply |
| Falcon 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish | Life Sciences | 353003 | general supply |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 352098 | general supply |
| Fisherbrand sterile cell strainers, 70 μm | Fisher Scientific | 22363548 | general supply |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | general supply |
| Hardened Fine Scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | general supply |
| Isothesia (Isoflurane) solution | Henry Schein | 29404 | Solution |
| Ketamine | Zoetis | 043-304 | injection |
| Kimwipes Delicate Task Wipers | Kimtech Science | KCC34155 | general supply |
| PBS pH7.4 (1X) | Gibco | 10010023 | Solution |
| RadDisk – Rodent Irradiator Disk | Braintree Scientific | IRD-P M | general supply |
| RPMI Medium 1640 (1X) | Gibco | 11875-093 | Medium |
| Sulfamethoxazole and Trimethoprim | TEVA | 0703-9526-01 | injection |
| Xylazine | Akorn | 139-236 | injection |
| X-ray irradiator | Rad source | RS-2000 | equipment |
References
- Evans, M. A., Sano, S., Walsh, K. Cardiovascular disease, aging, and clonal hematopoiesis. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 15 (1), 419-438 (2020).
- Welch, J. S., et al. The origin and evolution of mutations in acute myeloid leukemia. Cell. 150 (2), 264-278 (2012).
- Jaiswal, S., et al. Age-related clonal hematopoiesis associated with adverse outcomes. New England Journal of Medicine. 371 (26), 2488-2498 (2014).
- Dorsheimer, L., et al. Association of mutations contributing to conal hematopoiesis with prognosis in chronic ischemic heart failure. JAMA Cardiology. 4 (1), 25 (2019).
- Genovese, G., et al. Clonal hematopoiesis and blood-cancer risk inferred from blood DNA sequence. New England Journal of Medicine. 371 (26), 2477-2487 (2014).
- Jaiswal, S., et al. Clonal hematopoiesis and risk of atherosclerotic cardiovascular disease. New England Journal of Medicine. 377 (2), 111-121 (2017).
- Bick, A. G., et al. Genetic interleukin 6 signaling deficiency attenuates cardiovascular risk in clonal hematopoiesis. Circulation. 141 (2), 124-131 (2020).
- Fuster, J. J., et al. Clonal hematopoiesis associated with TET2 deficiency accelerates atherosclerosis development in mice. Science. 355 (6327), 842-847 (2017).
- Wang, Y., et al. Tet2-mediated clonal hematopoiesis in nonconditioned mice accelerates age-associated cardiac dysfunction. JCI Insight. 5 (6), 135204 (2020).
- Sano, S., et al. Tet2-mediated clonal hematopoiesis accelerates heart failure through a mechanism involving the IL-1β/NLRP3 inflammasome. Journal of the American College of Cardiology. 71 (8), 875-886 (2018).
- Sano, S., et al. JAK2-mediated clonal hematopoiesis accelerates pathological remodeling in murine heart failure. JACC: Basic to Translational Science. 4 (6), 684-697 (2019).
- Yu, K. R., et al. The impact of aging on primate hematopoiesis as interrogated by clonal tracking. Blood. 131 (11), 1195-1205 (2018).
- Sano, S., et al. CRISPR-mediated gene editing to assess the roles of Tet2 and Dnmt3a in clonal hematopoiesis and cardiovascular disease. Circulation Research. 123 (3), 335-341 (2018).
- Stachura, D. L., et al. Clonal analysis of hematopoietic progenitor cells in the zebrafish. Blood. 118 (5), 1274-1282 (2011).
- Gyurkocza, B., Sandmaier, B. M. Conditioning regimens for hematopoietic cell transplantation: one size does not fit all. Blood. 124 (3), 344-353 (2014).
- Bacigalupo, A., et al. Defining the intensity of conditioning regimens: working definitions. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 15 (12), 1628-1633 (2009).
- Abbuehl, J. P., Tatarova, Z., Held, W., Huelsken, J. Long-term engraftment of primary bone marrow stromal cells repairs niche damage and improves hematopoietic stem cell transplantation. Cell Stem Cell. 21 (2), 241-255 (2017).
- Shao, L., et al. Total body irradiation causes long-term mouse BM injury via induction of HSC premature senescence in an Ink4a- and Arf-independent manner. Blood. 123 (20), 3105-3115 (2014).
- Cui, Y. Z., et al. Optimal protocol for total body irradiation for allogeneic bone marrow transplantation in mice. Bone Marrow Transplantation. 30 (12), 843-849 (2002).
- Koch, A., et al. Establishment of early endpoints in mouse total-body irradiation model. PLOS One. 11 (8), 0161079 (2016).
- Ismaiel, A., Dumitraşcu, D. L. Cardiovascular risk in fatty liver disease: the liver-heart axis-literature review. Frontiers in Medicine. 6, 202 (2019).
- Amann, K., Wanner, C., Ritz, E. Cross-talk between the kidney and the cardiovascular system. Journal of the American Society of Nephrology. 17 (8), 2112-2119 (2006).
- Liao, X., et al. Distinct roles of resident and nonresident macrophages in nonischemic cardiomyopathy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (20), 4661-4669 (2018).
- Honold, L., Nahrendorf, M. Resident and monocyte-derived macrophages in cardiovascular disease. Circulation Research. 122 (1), 113-127 (2018).
- Lavine, K. J., et al. The macrophage in cardiac homeostasis and disease. Journal of the American College of Cardiology. 72 (18), 2213-2230 (2018).
- Ginhoux, F., Guilliams, M. Tissue-resident macrophage ontogeny and homeostasis. Immunity. 44 (3), 439-449 (2016).
- Mildner, A., et al. Microglia in the adult brain arise from Ly-6C hi CCR2+ monocytes only under defined host conditions. Nature Neuroscience. 10 (12), 1544-1553 (2007).
- Cronk, J. C., et al. Peripherally derived macrophages can engraft the brain independent of irradiation and maintain an identity distinct from microglia. Journal of Experimental Medicine. 215 (6), 1627-1647 (2018).
- Lu, R., Czechowicz, A., Seita, J., Jiang, D., Weissman, I. L. Clonal-level lineage commitment pathways of hematopoietic stem cells in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (4), 1447-1456 (2019).
- Gibson, B. W., et al. Comparison of cesium-137 and X-ray irradiators by using bone marrow transplant reconstitution in C57BL/6J mice. Comparative Medicine. 65 (3), 165-172 (2015).
- Cui, Y. Z., et al. Optimal protocol for total body irradiation for allogeneic bone marrow transplantation in mice. Bone Marrow Transplantation. 30 (12), 843-849 (2002).
- Kim, C. K., Yang, V. W., Bialkowska, A. B. The role of intestinal stem cells in epithelial regeneration following radiation-induced gut injury. Current Stem Cell Reports. 3 (4), 320-332 (2017).
