Klonal Hematopoez Çalışması İçin Farelerde Kemik İliği Nakli İşlemleri
Summary
Kemik iliği naklinin (BMT) üç yöntemini tarif ediyoruz: toplam vücut ışınlamalı BMT, korumalı ışınlamalı BMT ve fare modellerinde klonal hematopoez çalışması için ön koşullandırması olmayan BMT yöntemi (benimseyen BMT).
Abstract
Klonal hematopoez, hematopoetik kök ve progenitör hücrelerde (HSPC) somatik mutasyonların birikmesinden kaynaklanan yaygın bir yaşla ilişkili durumdur. Sürücü genlerindeki mutasyonlar, hücresel zindelik sağlayan, somatik mutasyonu barındıran progeny lökositlere giderek daha fazla yol açan genişleyen HSPC klonlarının gelişmesine yol açabilir. Klonal hematopoez kalp hastalığı, inme ve mortalite ile ilişkili olduğundan, bu süreçleri modelleyen deneysel sistemlerin geliştirilmesi, bu yeni risk faktörünün altında yer alan mekanizmaları anlamanın anahtarıdır. Toplam vücut ışınlama (TBI) gibi farelerde miyeloablatif koşullandırmayı içeren kemik iliği nakli prosedürleri, bağışıklık hücrelerinin kardiyovasküler hastalıklardaki rolünü incelemek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Bununla birlikte, kemik iliği nişine ve kalp ve beyin gibi diğer ilgi alanlarına eşzamanlı hasar, bu prosedürlerle kaçınılmazdır. Bu nedenle laboratuvarımız TBI’ın neden olduğu olası yan etkileri en aza indirmek veya önlemek için iki alternatif yöntem geliştirmiştir: 1) ışınlama kalkanı ile kemik iliği nakli ve 2) koşulsuz farelere benimseyen BMT. Korumalı organlarda, lokal çevre korunarak klonal hematopoez analizine izin verirken, yerleşik bağışıklık hücrelerinin işlevi bozulmamıştır. Buna karşılık, koşullanmamış farelere benimseyen BMT, hem organların yerel ortamlarının hem de hematopoetik nişinin korunması ek avantaja sahiptir. Burada, üç farklı hematopoetik hücre rekonstrüt yaklaşımını karşılaştırıyoruz ve kardiyovasküler hastalıkta klonal hematopoez çalışmaları için güçlü yönlerini ve sınırlamalarını tartışıyoruz.
Introduction
Klonal hematopoez (CH), yaşlı bireylerde sıklıkla gözlenen ve genetik mutasyon taşıyan genişletilmiş hematopoetik kök ve progenitör hücre (HSPC) klonunun bir sonucu olarak ortaya çıkan bir durumdur1. 50 yaşına kadar, çoğu bireyin her HSPC2’deortalama beş eksonik mutasyon elde etmiş olacağı ileri sürülmektedir , ancak bu mutasyonların çoğu birey için çok az fenotipik sonuçlara neden olacaktır. Bununla birlikte, bu mutasyonlardan biri HSPC’ye rekabet avantajı sağlıyorsa (örneğin, çoğalmasını, kendini yenilemesini, hayatta kalmasını veya bunların bir kombinasyonunu teşvik ederek), bu mutant klonun diğer HSPC’lere göre tercihli genişlemesine yol açabilir. Sonuç olarak, mutasyona uğramış HSPC olgun kan hücrelerine yol açtıkça mutasyon hematopoetik sisteme giderek daha fazla yayılacak ve periferik kan içinde mutasyona uğramış hücrelerin farklı bir popülasyonuna yol açacaktır. Onlarca farklı aday sürücü genlerindeki mutasyonlar hematopoetik sistem içindeki klonal olaylarla ilişkili olsa da, bunlar arasında DNA metiltransferaz 3 alfa (DNMT3A) ve on bir translokasyon 2 (TET2) mutasyonları en yaygın3 ‘tür. Çeşitli epidemiyolojik çalışmalar, bu genetik mutasyonları taşıyan bireylerin kardiyovasküler hastalık (CVD), inme ve tüm nedensel mortalite3, 4 ,5,6,7riskinin önemli ölçüde daha yüksek olduğunu bulmuştur. Bu çalışmalar CH ile CVD ve inme insidansının artması arasında bir ilişki olduğunu tespit etmekle birlikte, bu ilişkinin nedensel mi yoksa yaşlanma süreci ile paylaşılan bir epifenomenon mu olduğunu bilmiyoruz. Bu ilişkinin daha iyi anlaşılması için, CH’nin insan durumunu doğru bir şekilde özetleyen uygun hayvan modelleri gereklidir.
Zebra balığı, fare ve insan dışı primatlar 8 , 9 , 10 , 11,12,13,14kullanılarak grubumuz ve diğerleri tarafından çeşitli CH hayvan modelleri kurulmuştur. Bu modeller genellikle genetiği değiştirilmiş hücrelerin nakliyle, bazen Cre-lox rekombinasyonunu veya CRISPR sistemini kullanarak hematopoetik rekonsyon yöntemlerini kullanır. Bu yaklaşım, hematopoetik hücrelerdeki belirli bir gen mutasyonunun hastalık gelişimine nasıl katkıda bulunduğunu değerlendirmek için analizini sağlar. Ek olarak, bu modeller genellikle mutant hücrelerin etkilerini normal veya vahşi tip hücrelerden ayırt etmek için konjenik veya muhabir hücreler kullanır. Çoğu durumda, donör hematopoetik kök hücreleri başarılı bir şekilde engrafe etmek için bir ön koşullandırma rejimi gereklidir.
Şu anda, kemik iliğinin alıcı farelere nakli iki ana kategoriye ayrılabilir: 1) miyeloablatif şartlandırma ve 2) koşulsuz transplantasyon. Miyeloablatif koşullandırma, toplam vücut ışınlama (TBI) veya kemoterapi15olmak üzere iki yöntemden biriyle elde edilebilir. TBI, alıcıyı ölümcül bir gama veya X-ışını ışınlama dozuna tabi tutularak, hızla bölünen hücrelerde DNA kırılmaları veya çapraz bağlantılar üreterek, onarılamaz hale getirerekgerçekleştirilir 16. Busulfan ve siklofosfamide, hematopoetik nişi bozan ve benzer şekilde hızla bölünen hücrelere DNA hasarı veren iki yaygın olarak kullanılan kemoterapi ilacıdır. Miyeloablatif önkoşulların net sonucu, alıcının hematopoetik sistemini yok eden hematopoetik hücrelerin apoptozudur. Bu strateji sadece donör HSPC’lerin başarılı bir şekilde yerleştirilmesine izin verir, aynı zamanda alıcının bağışıklık sistemini baskılayarak greft reddini de önleyebilir. Bununla birlikte, miyeloablatif önkoşul, doku ve organlara ve yerleşik bağışıklık hücrelerine zarar vermenin yanı sıra yerli kemik iliği nişinin tahrip edilmesi gibi ciddi yan etkilere sahiptir17. Bu nedenle, özellikle ilgi organlarının zarar görmesi açısından, bu istenmeyen yan etkilerin üstesinden gelmek için alternatif yöntemler önerilmiştir. Bu yöntemler, alıcı farelerin korumalı ışınlanması ve koşulsuz farelere benimseyen BMT9,17. Bir kurşun bariyerlerin yerleştirilmesiyle toraks, karın boşluğu, kafa veya diğer bölgeleri ışınlamadan korumak, ilgi çekici dokuları ışınlamanın zarar verici etkilerinden korur ve yerleşik bağışıklık hücresi popülasyonlarını korur. Öte yandan, HSPC’lerin koşullanmamış farelere benimseyen BMT’si, doğal hematopoetik niş koruduğu için ek bir avantaja sahiptir. Bu yazıda, farelerde birkaç transplantasyon rejiminden sonra HSPC engraftasyonunun protokollerini ve sonuçlarını, özellikle HSPC’nin TBI farelerine, ışınlamadan kısmen korunan farelere ve koşulsuz farelere teslimini açıklıyoruz. Genel amaç, araştırmacıların her yöntemin farklı fizyolojik etkilerini ve CH ve kardiyovasküler hastalıkların ayarlanmasındaki deneysel sonuçları nasıl etkilediklerini anlamalarına yardımcı olmaktır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Klonal hematopoez çalışmaları için üç BMT yöntemi tanımladık: total vücut ışınlamalı BMT, kısmi kalkanlı ışınlamalı BMT ve ön koşullandırma içermeyen daha az yaygın olarak kullanılan bir BMT yöntemi (benimsenen BMT). Bu yöntemler klonal hematopoezin kardiyovasküler hastalık üzerindeki etkisini değerlendirmek için kullanılmıştır. Araştırmacılar bu yöntemleri çalışmalarının özel amacına uyacak şekilde değiştirebilirler.
Klonal hematopoe…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından K. Walsh’a (HL131006, HL138014 ve HL132564), S. Sano’ya (HL152174), M. A. Evans’a Amerikan Kalp Derneği hibesi (20POST35210098) ve H. Ogawa’ya Japonya Kalp Vakfı hibesi ile desteklendi.
Materials
| 0.5ml microcentrifuge | Fisher Scientific | 05-408-121 | general supply |
| 1.5ml microcentrifuge | Fisher Scientific | 05-408-129 | general supply |
| 1/2 cc LO-DOSE INSULIN SYRINGE | EXELINT | 26028 | general supply |
| Absolute Ethanol (200 prfof) | Fisher chemical | 200559 | general supply |
| BD 1mL Tuberculin Syringes 25G 5/8 Inch Needle | Becton Dickinson | 309626 | general supply |
| BD PrecisionGlide Needle 18G (1.22mm X 25mm) | Becton Dickinson | 395195 | general supply |
| Cesium-137 Irradiator | J. L. Shepherd | Mark IV | equipment |
| DietGel 76A | Clear H2O | 70-01-5022 | general supply |
| Falcon 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish | Life Sciences | 353003 | general supply |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 352098 | general supply |
| Fisherbrand sterile cell strainers, 70 μm | Fisher Scientific | 22363548 | general supply |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | general supply |
| Hardened Fine Scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | general supply |
| Isothesia (Isoflurane) solution | Henry Schein | 29404 | Solution |
| Ketamine | Zoetis | 043-304 | injection |
| Kimwipes Delicate Task Wipers | Kimtech Science | KCC34155 | general supply |
| PBS pH7.4 (1X) | Gibco | 10010023 | Solution |
| RadDisk – Rodent Irradiator Disk | Braintree Scientific | IRD-P M | general supply |
| RPMI Medium 1640 (1X) | Gibco | 11875-093 | Medium |
| Sulfamethoxazole and Trimethoprim | TEVA | 0703-9526-01 | injection |
| Xylazine | Akorn | 139-236 | injection |
| X-ray irradiator | Rad source | RS-2000 | equipment |
References
- Evans, M. A., Sano, S., Walsh, K. Cardiovascular disease, aging, and clonal hematopoiesis. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 15 (1), 419-438 (2020).
- Welch, J. S., et al. The origin and evolution of mutations in acute myeloid leukemia. Cell. 150 (2), 264-278 (2012).
- Jaiswal, S., et al. Age-related clonal hematopoiesis associated with adverse outcomes. New England Journal of Medicine. 371 (26), 2488-2498 (2014).
- Dorsheimer, L., et al. Association of mutations contributing to conal hematopoiesis with prognosis in chronic ischemic heart failure. JAMA Cardiology. 4 (1), 25 (2019).
- Genovese, G., et al. Clonal hematopoiesis and blood-cancer risk inferred from blood DNA sequence. New England Journal of Medicine. 371 (26), 2477-2487 (2014).
- Jaiswal, S., et al. Clonal hematopoiesis and risk of atherosclerotic cardiovascular disease. New England Journal of Medicine. 377 (2), 111-121 (2017).
- Bick, A. G., et al. Genetic interleukin 6 signaling deficiency attenuates cardiovascular risk in clonal hematopoiesis. Circulation. 141 (2), 124-131 (2020).
- Fuster, J. J., et al. Clonal hematopoiesis associated with TET2 deficiency accelerates atherosclerosis development in mice. Science. 355 (6327), 842-847 (2017).
- Wang, Y., et al. Tet2-mediated clonal hematopoiesis in nonconditioned mice accelerates age-associated cardiac dysfunction. JCI Insight. 5 (6), 135204 (2020).
- Sano, S., et al. Tet2-mediated clonal hematopoiesis accelerates heart failure through a mechanism involving the IL-1β/NLRP3 inflammasome. Journal of the American College of Cardiology. 71 (8), 875-886 (2018).
- Sano, S., et al. JAK2-mediated clonal hematopoiesis accelerates pathological remodeling in murine heart failure. JACC: Basic to Translational Science. 4 (6), 684-697 (2019).
- Yu, K. R., et al. The impact of aging on primate hematopoiesis as interrogated by clonal tracking. Blood. 131 (11), 1195-1205 (2018).
- Sano, S., et al. CRISPR-mediated gene editing to assess the roles of Tet2 and Dnmt3a in clonal hematopoiesis and cardiovascular disease. Circulation Research. 123 (3), 335-341 (2018).
- Stachura, D. L., et al. Clonal analysis of hematopoietic progenitor cells in the zebrafish. Blood. 118 (5), 1274-1282 (2011).
- Gyurkocza, B., Sandmaier, B. M. Conditioning regimens for hematopoietic cell transplantation: one size does not fit all. Blood. 124 (3), 344-353 (2014).
- Bacigalupo, A., et al. Defining the intensity of conditioning regimens: working definitions. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 15 (12), 1628-1633 (2009).
- Abbuehl, J. P., Tatarova, Z., Held, W., Huelsken, J. Long-term engraftment of primary bone marrow stromal cells repairs niche damage and improves hematopoietic stem cell transplantation. Cell Stem Cell. 21 (2), 241-255 (2017).
- Shao, L., et al. Total body irradiation causes long-term mouse BM injury via induction of HSC premature senescence in an Ink4a- and Arf-independent manner. Blood. 123 (20), 3105-3115 (2014).
- Cui, Y. Z., et al. Optimal protocol for total body irradiation for allogeneic bone marrow transplantation in mice. Bone Marrow Transplantation. 30 (12), 843-849 (2002).
- Koch, A., et al. Establishment of early endpoints in mouse total-body irradiation model. PLOS One. 11 (8), 0161079 (2016).
- Ismaiel, A., Dumitraşcu, D. L. Cardiovascular risk in fatty liver disease: the liver-heart axis-literature review. Frontiers in Medicine. 6, 202 (2019).
- Amann, K., Wanner, C., Ritz, E. Cross-talk between the kidney and the cardiovascular system. Journal of the American Society of Nephrology. 17 (8), 2112-2119 (2006).
- Liao, X., et al. Distinct roles of resident and nonresident macrophages in nonischemic cardiomyopathy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (20), 4661-4669 (2018).
- Honold, L., Nahrendorf, M. Resident and monocyte-derived macrophages in cardiovascular disease. Circulation Research. 122 (1), 113-127 (2018).
- Lavine, K. J., et al. The macrophage in cardiac homeostasis and disease. Journal of the American College of Cardiology. 72 (18), 2213-2230 (2018).
- Ginhoux, F., Guilliams, M. Tissue-resident macrophage ontogeny and homeostasis. Immunity. 44 (3), 439-449 (2016).
- Mildner, A., et al. Microglia in the adult brain arise from Ly-6C hi CCR2+ monocytes only under defined host conditions. Nature Neuroscience. 10 (12), 1544-1553 (2007).
- Cronk, J. C., et al. Peripherally derived macrophages can engraft the brain independent of irradiation and maintain an identity distinct from microglia. Journal of Experimental Medicine. 215 (6), 1627-1647 (2018).
- Lu, R., Czechowicz, A., Seita, J., Jiang, D., Weissman, I. L. Clonal-level lineage commitment pathways of hematopoietic stem cells in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (4), 1447-1456 (2019).
- Gibson, B. W., et al. Comparison of cesium-137 and X-ray irradiators by using bone marrow transplant reconstitution in C57BL/6J mice. Comparative Medicine. 65 (3), 165-172 (2015).
- Cui, Y. Z., et al. Optimal protocol for total body irradiation for allogeneic bone marrow transplantation in mice. Bone Marrow Transplantation. 30 (12), 843-849 (2002).
- Kim, C. K., Yang, V. W., Bialkowska, A. B. The role of intestinal stem cells in epithelial regeneration following radiation-induced gut injury. Current Stem Cell Reports. 3 (4), 320-332 (2017).
