Vi beskriver tre metoder til knoglemarvstransplantation (BMT): BMT med total kropsbestråling, BMT med afskærmet bestråling og BMT-metode uden prækonditionering (adoptiv BMT) til undersøgelse af klonisk hæmatopoiesis i musemodeller.
Clonal hæmatopoiesis er en udbredt aldersrelateret tilstand, der skyldes akkumulering af somatiske mutationer i hæmatopoietiske stamceller og stamceller (HSC’er). Mutationer i førergener, der giver cellulær fitness, kan føre til udvikling af ekspanderende HSPC-kloner, der i stigende grad giver anledning til afkom leukocytter, der huser den somatiske mutation. Fordi klonisk hæmatopoiesis har været forbundet med hjertesygdomme, slagtilfælde og dødelighed, er udviklingen af eksperimentelle systemer, der modellerer disse processer, nøglen til at forstå de mekanismer, der underly denne nye risikofaktor. Knoglemarvstransplantationsprocedurer, der involverer myeloablativ konditionering hos mus, såsom bestråling af hele kroppen (TBI), anvendes ofte til at studere immuncellernes rolle i hjerte-kar-sygdomme. Men samtidig skade på knoglemarvsnicher og andre steder af interesse, såsom hjerte og hjerne, er uundgåelig med disse procedurer. Således har vores laboratorium udviklet to alternative metoder til at minimere eller undgå mulige bivirkninger forårsaget af TBI: 1) knoglemarvstransplantation med bestrålingsafskærmning og 2) adoptiv BMT til ikke-konditionerede mus. I afskærmede organer bevares det lokale miljø, hvilket giver mulighed for analyse af klonisk hæmatopoiesis, mens funktionen af bosiddende immunceller er uforstyrret. I modsætning hertil har den adoptiv BMT til ikke-betingede mus den yderligere fordel, at både de lokale miljøer af organerne og den hæmatopoietiske niche bevares. Her sammenligner vi tre forskellige hæmatopoietiske cellerekonstruktionsmetoder og diskuterer deres styrker og begrænsninger for undersøgelser af klonisk hæmatopoiesis i hjerte-kar-sygdomme.
Clonal hematopoiesis (CH) er en tilstand, der ofte observeres hos ældre personer og opstår som følge af en udvidet hæmatopoietisk stamcelle- og stamcelleklon (HSPC), der bærer en genetisk mutation1. Det er blevet foreslået, at i en alder af 50, de fleste individer vil have erhvervet et gennemsnit på fem exonic mutationer i hver HSPC2, men de fleste af disse mutationer vil resultere i ringe eller ingen fænotypiske konsekvenser for den enkelte. Men hvis en af disse mutationer ved en tilfældighed giver HSPC en konkurrencemæssig fordel – f.eks. ved at fremme dens spredning, selvfornyelse, overlevelse eller en kombination af disse – kan dette føre til præferenceudvidelsen af den mutante klon i forhold til de andre HSC’er. Som følge heraf vil mutationen i stigende grad sprede sig gennem det hæmatopoietiske system, da det muterede HSPC giver anledning til modne blodlegemer, hvilket fører til en tydelig population af muterede celler i det perifere blod. Mens mutationer i snesevis af forskellige kandidat driver gener har været forbundet med kloniske begivenheder inden for hæmatopoietiske system, blandt disse, mutationer i DNA methyltransferase 3 alpha (DNMT3A) og ti elleve translokation 2 (TET2) er de mest udbredte3. Flere epidemiologiske undersøgelser har vist, at personer, der bærer disse genetiske mutationer, har en betydeligt højere risiko for hjerte-kar-sygdom (CVD), slagtilfælde og all-kausaldødelighed 3,4,5,6,7. Mens disse undersøgelser har identificeret, at der er en sammenhæng mellem CH og øget forekomst af CVD og slagtilfælde, ved vi ikke, om dette forhold er årsagssammenhæng eller en fælles epiphenomenon med aldringsprocessen. For at få en bedre forståelse af denne forening kræves der korrekte dyremodeller, der korrekt opsummerer CH’s menneskelige tilstand.
Flere CH dyremodeller er blevet etableret af vores gruppe og andre ved hjælp af zebrafisk, mus og ikke-menneskelige primater8,9,10,11,12,13,14. Disse modeller anvender ofte hæmatopoietiske rekonstitutionsmetoder ved transplantation af genetisk modificerede celler, nogle gange ved hjælp af Cre-lox rekombination eller CRISPR-systemet. Denne tilgang giver mulighed for analyse af en specifik genmutation i hæmatopoietiske celler for at vurdere, hvordan det bidrager til sygdomsudvikling. Derudover anvender disse modeller ofte congeniske eller reporterceller til at skelne virkningerne af mutantceller fra normale eller vilde celler. I mange tilfælde er en pre-conditioning regime er forpligtet til at kunne engraft donor hæmatopoietiske stamceller.
I øjeblikket kan transplantationen af knoglemarv til recipientmus opdeles i to hovedkategorier: 1) myeloablativ konditionering og 2) ikke-betinget transplantation. Myeloablativ konditionering kan opnås ved en af to metoder, nemlig total kropsbestråling (TBI) eller kemoterapi15. TBI udføres ved at udsætte modtageren for en dødelig dosis gamma- eller røntgenbestråling, generere DNA-brud eller krydsforbindelser i hurtigt dividere celler, hvilket gør dem uoprettelige16. Busulfan og cyclophosphamide er to almindeligt anvendte kemoterapi lægemidler, der forstyrrer den hæmatopoietiske niche og ligeledes forårsage DNA-skader på hurtigt at opdele celler. Nettoresultatet af myeloablativ forudsætning er apoptose af hæmatopoietiske celler, som ødelægger modtagerens hæmatopoietiske system. Denne strategi giver ikke kun mulighed for en vellykket engraftment af donor HSC’er, men kan også forhindre graft afvisning ved at undertrykke modtagerens immunsystem. Men myeloablative forudsætninger har alvorlige bivirkninger såsom skader på væv og organer og deres hjemmehørende immunceller samt ødelæggelse af den indfødte knoglemarvsnicher17. Der er derfor foreslået alternative metoder til at overvinde disse uønskede bivirkninger, navnlig med hensyn til skader på organer af interesse. Disse metoder omfatter afskærmet bestråling af recipientmus og adoptiv-BMT til ikke-betingede mus9,17. Afskærmning af brystkassen, bughulen, hovedet eller andre regioner mod bestråling ved placering af blybarrierer beskytter væv af interesse mod de skadelige virkninger af bestråling og opretholder deres bosiddende immuncellepopulation. På den anden side har den adoptiv BMT af HSC’er til ikke-betingede mus en yderligere fordel, fordi den bevarer den indfødte hæmatopoietiske niche. I dette manuskript beskriver vi protokollerne og resultaterne af HSPC-engraftment efter flere transplantationsregimer hos mus, specifikt levering af HSPC til TBI-mus, til mus, der delvist er afskærmet mod bestråling, og til ikke-betingede mus. Det overordnede mål er at hjælpe forskerne med at forstå de forskellige fysiologiske virkninger af hver metode samt hvordan de påvirker eksperimentelle resultater i fastsættelsen af CH og hjerte-kar-sygdomme.
Til undersøgelser af blodlegemer beskrev vi tre metoder til BMT: BMT med total kropsbestråling, BMT med bestråling med delvis afskærmning og en mindre almindeligt anvendt BMT-metode, der ikke involverer prækonditionering (adoptiv BMT). Disse metoder er blevet brugt til at vurdere virkningen af klonisk hæmatopoies på hjerte-kar-sygdomme. Forskere kan ændre disse metoder i overensstemmelse hermed, så de passer til det specifikke formål med deres undersøgelse.
Clonal hæmatopoi…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af US National Institutes of Health tilskud til K. Walsh (HL131006, HL138014, og HL132564), til S. Sano (HL152174), American Heart Association tilskud til M. A. Evans (20POST35210098), og en Japan Heart Foundation tilskud til H. Ogawa.
0.5ml microcentrifuge | Fisher Scientific | 05-408-121 | general supply |
1.5ml microcentrifuge | Fisher Scientific | 05-408-129 | general supply |
1/2 cc LO-DOSE INSULIN SYRINGE | EXELINT | 26028 | general supply |
Absolute Ethanol (200 prfof) | Fisher chemical | 200559 | general supply |
BD 1mL Tuberculin Syringes 25G 5/8 Inch Needle | Becton Dickinson | 309626 | general supply |
BD PrecisionGlide Needle 18G (1.22mm X 25mm) | Becton Dickinson | 395195 | general supply |
Cesium-137 Irradiator | J. L. Shepherd | Mark IV | equipment |
DietGel 76A | Clear H2O | 70-01-5022 | general supply |
Falcon 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish | Life Sciences | 353003 | general supply |
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 352098 | general supply |
Fisherbrand sterile cell strainers, 70 μm | Fisher Scientific | 22363548 | general supply |
Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | general supply |
Hardened Fine Scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | general supply |
Isothesia (Isoflurane) solution | Henry Schein | 29404 | Solution |
Ketamine | Zoetis | 043-304 | injection |
Kimwipes Delicate Task Wipers | Kimtech Science | KCC34155 | general supply |
PBS pH7.4 (1X) | Gibco | 10010023 | Solution |
RadDisk – Rodent Irradiator Disk | Braintree Scientific | IRD-P M | general supply |
RPMI Medium 1640 (1X) | Gibco | 11875-093 | Medium |
Sulfamethoxazole and Trimethoprim | TEVA | 0703-9526-01 | injection |
Xylazine | Akorn | 139-236 | injection |
X-ray irradiator | Rad source | RS-2000 | equipment |