זרימת עבודה פרוטאומית כמותית ללא תוויות עבור אינטראקציות מארח-פתוגן מונחות גילוי
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול לפרופיל יחסי הגומלין בין מארח לפתוגן במהלך זיהום על ידי פרוטאומיקה מבוססת ספקטרומטריה המונית. פרוטוקול זה משתמש כימות ללא תווית כדי למדוד שינויים בשפע החלבון של המארח (למשל, מקרופאגים) ופתוגן (למשל, Cryptococcus neoformans) בניסוי אחד.
Abstract
ההישגים הטכנולוגיים של ספקטרומטריית מסה (MS) מבוססי פרוטאומיקה כמותית פותחים אפיקים רבים שטרם התגלו לניתוח הפרוטאום העולמי של האורגניזם בתנאים משתנים. אסטרטגיה רבת עוצמה זו המיושמת על האינטראקציות של פתוגנים מיקרוביאליים עם המארח הרצוי מאפיינת באופן מקיף את שתי נקודות המבט כלפי זיהום. בזאת, זרימת העבודה מתארת כימות ללא תווית (LFQ) של ההדבקה של Cryptococcus neoformans, פתוגן תאי פטרייתי פטרייתי שהוא הסוכן הסיבתי של המחלה הקטלנית cryptococcosis, בנוכחות תאי מקרופאגים מונצחים. הפרוטוקול מפרט את טכניקות הכנת החלבון המתאימות הן לתאי פתוגן והן לתאי יונקים בניסוי אחד, וכתוצאה מכך הגשת פפטיד מתאימה לניתוח כרומטוגרפיה נוזלית (LC)-MS/MS. האופי הגנרי בעל התפוקה הגבוהה של LFQ מאפשר מגוון דינמי רחב של זיהוי וכימות חלבונים, כמו גם יכולת העברה לכל הגדרת זיהום מארח-פתוגן, תוך שמירה על רגישות קיצונית. השיטה מותאמת לקטלוג פרופילי שפע חלבון נרחבים ובלתי משוחדים של פתוגן בתנאים של חיקוי זיהום. באופן ספציפי, השיטה המודגמת כאן מספקת מידע חיוני על C. neoformans pathogenesis, כגון ייצור חלבונים הדרושים לארסיות ומזהה חלבונים מארחים קריטיים המגיבים לפלישה מיקרוביאלית.
Introduction
השכיחות של זיהומים פטרייתיים פולשניים גדלה במידה ניכרת והיא מתואמת עם שיעורי תמותה גבוהים באופן בלתי מתקבל על הדעת, המדווחים בדרך כלל אצל אנשים עם נטייה אימונודפטית1. Cryptococcus neoformans הוא פתוגן פטרייתי אופורטוניסטי ידוע לשמצה המסוגל לשרוד תאיים בתוך תאי מקרופאג מארחים. התערבות פטרייתית לקויה גורמת להפצה פטרייתית וביטויים מסכני חיים של דלקת קרום המוח cryptococcal ודלקת קרום המוח2,3. העלייה העולמית במעמד immunocompromised דרשה עלייה מקבילה בשימוש בחומרים נגד פטריות, שבו מינים פטרייתיים רבים, כולל C. neoformans, פיתחו יותר ויותר התנגדות כלפי4,5,6. לכן, חובה ליישם טכנולוגיות חזקות ויעילות כדי לענות על שאלות ביולוגיות חיוניות לגבי תגובת ההגנה המארחת ופתוגנזה מיקרוביאלית.
העידן החדש של התקדמות טכנולוגית בספקטרומטריית מסה (MS), כולל יצירת צינורות חישוביים וביואינפורמטיים רבי עוצמה, מספק את הבסיס לחזון אינטגרטיבי לניתוח בקנה מידה גדול של מחקרמארח-פתוגן 7,8. ניתוח פרוטאומי קונבנציונלי מונחה פתוגנזה בדרך כלל פרופילים ההשקפה של זיהום מנקודת המבט המארח או פתוגן, כולל מתודולוגיות מקיפות כגון פרופיל מתאם חלבון, כרומטוגרפיה זיקה בשילוב עם פרוטאומיקה, ו אינטראקציה9. חקירות על ארסיות של פתוגנים מסוכנים במערכת מארחת הן בעלות חשיבות קלינית עצומה; עם זאת, היישום של ניתוח פרספקטיבה כפולה בניסוי יחיד נחשב בעבר לבלתי ניתן להשגה. לדוגמה, נקודת המבט של הפתוגן כלפי זיהום הוא המום לעתים קרובות על ידי חלבונים מארחים בשפע מאוד וכתוצאה מכך רגישות מופחתת לגילוי של חלבונים פטרייתיים בשפע נמוך7. יתר על כן, מורכבות המדגם הגבוהה מזמינה מטרות רבות לחקור במערכת ניסיונית אחת ומוכיחה מאתגרת להבהיר מנגנוני פעולה לחלבון פתוגן ספציפי.
פרוטאומיקה מלמטה למעלה היא טכניקת MS פופולרית המאפשרת הכנת מדגם לניהול, שבה פפטידים נוצרים על ידי עיכול אנזימטי ספציפי לרצף ואחריו הפרדת כרומטוגרפיה נוזלית, זיהוי וכימות על ידי MS10,11. כאן, אנו מציגים שיטה המדגימה אסטרטגיית רכישה תלוית נתונים שמטרתה להשיג כיסוי לא משוחד של פרוטאום מבוסס זיהום או ‘זיהום’. באופן ספציפי, כימות ללא תווית (LFQ) שופך את התלות בתוויות כימיות או מטבוליות לזיהוי חזק ומדויק של שינויים ברמת החלבון על פני פרוטאומים מרובים, הפחתת טיפול במדגם ועיבוד שלבים12,13. יישום אוניברסלי זה חוקר חלבונים המיוצרים ברגע נתון בתוך תא ללא תלות בכל ייצור חלבון צפוי; לכן, תובנות חדשניות עשויות להתגלות כי הם קריטיים לזיהום.
זרימת העבודה המתוארת בזאת מותאמת במיוחד כדי לחקור שינויים ברמת החלבון של C. neoformans במהלך תנאי חיקוי זיהום עם תאים חיסוניים מארחים (איור 1). במקום להסתמך על בידוד והפרדה של סוגי תאים, גישה זו מחלצת את פרוטאום המארח והפתוגן יחד, ומשתמשת בהפרדה ביואינפורמטית באמצעות שני מסדי נתונים ספציפיים לאורגניזם כדי להבחין בין ייצור חלבונים ספציפי למינים. שיטה זו מציעה יתרונות עבור מספר בלתי מוגבל של דגימות להיות מעובד ללא שלבי הכנה יקרים במיוחד הדרושים במחקרי תיוג מבוססי איזוטופ או שבר. יתר על כן, זרימת עבודה זו תומכת בפרוטוקולי מיצוי חלבונים ממוטבים הניתנים להעברה למגוון רחב של פתוגנים פטרייתיים ובקטריאליים המסוגלים למקד ולהדביק תאים חיסוניים מארחים. בסך הכל, פרוטוקול זה מתאר את השלבים להשלמת מיצוי חלבון לא משוחד ועיבוד מדגם לטרשת נפוצה ברזולוציה גבוהה, ואחריו נתונים וניתוח סטטיסטי, המסוגלים לספק שפע של ידע בחלבונים פטרייתיים משמעותיים לזיהום בשילוב עם פרופיל מקיף של תגובת ההגנה המארחת.
Protocol
Representative Results
Discussion
השלבים הקריטיים בפרוטוקול כוללים הכנת תאי מקרופאג ואיסוף דגימות תרבות משותפת לעיבוד חלבונים עם הפרעה מינימלית לתאים. חשוב לבצע שלבים של כביסה, מחוסן והסרה של תאי מקרופאגים חסידים בעדינות ובזהירות כדי למנוע תמוגה מיותרת של תאים לפני האיסוף. הקמת MOI הנכון עבור הניסוי הוא גם קריטי כמו מחוסן …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים לד”ר ג’ונתן קריגר מ-Bioinformatics Solutions Inc. על הפעלת ספקטרומטר המסה לניסויים ייצוגיים, כמו גם לחברי קבוצת גדס-מקליסטר על עזרתם בהקמה ניסיונית ובמשוב לכתבי יד. המחברים מכירים בתמיכה במימון, בין השאר, מקרן המחקר בנטינג – פרס גילוי מלגת ג’ירסלובסקי, הקרן החדשה למחקר גבולות – חקר (NFRFE-2019-00425), והקרן הקנדית לחדשנות (JELF 38798) עבור J.G.M., כמו גם NSERC קנדה בוגר מלגת – מאסטרס אונטריו בוגר מלגת B.B., ואת המלכה אליזבת השנייה בוגר מלגת מדע וטכנולוגיה עבור A.S..
Materials
| 100 mM Tris-HCl, pH 8.5 | Fisher Scientific | BP152-1 | Maintain at 4°C |
| 60 x 15 mm Dish, Nunclon Delta | ThermoFisher Scientific | 174888 | |
| 6-well cell culture plate | ThermoFisher Scientific | 140675 | |
| Acetonitrile, MS grade | Pierce | TS-51101 | |
| Acetic Acid | Sigma Aldrich | 1099510001 | |
| Acetone | Sigma Aldrich | 34850-1L | |
| Ammonium bicarbonate (ABC) | ThermoFisher Scientific | A643-500 | Prepare a stock 50 mM ABC solution, stable at room temperature for up to one month. |
| Bel-Art™ HiFlow Vacuum Aspirator Collection System | Fisher Scientific | 13-717-300 | Not essential, serological pipettes can be used to remove media. |
| C18 resin | 3M Empore | 3M2215 | |
| Cell Scrapers | VWR | 10062-906 | Not essential, other methods to release macrophage cells can be used. |
| Centrifugal vaccuum concentrator | Eppendorf | 07-748-15 | |
| Complete Filtration Unit | VWR | 10040-436 | |
| Conical falcon tubes (15 mL) | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
| Countess II Automated Cell Counter | ThermoFisher Scientific | AMQAX1000 | Not essential, haemocytometer can be used as an alternative. |
| CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay | Promega | G1780 | |
| Dithiothreitol (DTT) | ThermoFisher Scientific | R0861 | Prepare bulk stock solution of 1 M DTT, flash frozen and stored at -20 °C until use. Discard after each use (do not freeze-thaw repeatedly). |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement | ThermoFisher Scientific | 10566016 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher Scientific | 12483020 | Heat inactivate by incubating at 60°C for 30 minutes. Prepare 50 ml aliquots and flash freeze. Thaw prior to media preparation |
| Haemocytometer | VWR | 15170-208 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | Prepare 40 mM HEPES/8 M Urea in bulk stock solution, flash frozen, store at -20°C until use. Discard after each use (do not freeze-thaw repeatedly). |
| High-performance liquid chromatography system | ThermoFisher Scientific | LC140 | Gradient length is based on sample complexity, recommended 120 min gradient for infectome samples. |
| High-resolution mass spectrometer | ThermoFisher Scientific | 726042 | |
| Iodoacetamide (IAA) | Sigma Aldrich | I6125 | Prepare 0.55 M bulk stock solution, flash frozen, store at -20°C until use. Discard after each use (do not freeze-thaw repeatedly). |
| L-glutamine | ThermoFisher Scientific | 25030081 | Can be aliquot and frozen for storage. Thaw prior to media preparation. |
| LoBind Microcentrifuge tubes | Eppendorf | 13-698-794 | |
| MaxQuant | https://maxquant.org/ | MaxQuant is a public platform that offers tutorials, such as the MaxQuant Summer School, outlining the computational analysis steps of large MS data sets | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 13864457 | |
| Penicillin : Streptomycin 10k/10k | VWR | CA12001-692 | Can be aliquot and frozen for storage. Thaw prior to media preparation. |
| Peptide separation columns | ThermoFisher Scientific | ES803 | |
| Perseus Software | http://maxquant.net/perseus/ | ||
| Phosphate Buffered Saline | VWR | CA12001-676 | Puchase not required. PBS can also be prepared but sterile filteration must be performed before use. |
| Pierce BCA Protein Assay | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
| Pipette, Disposable Serological (10 mL) | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
| Pipette, Disposable Serological (25 mL) Basix | Fisher Scientific | 14955235 | |
| Probe sonciator | ThermoFisher Scientific | 100-132-894 | |
| Protease inhibitor cocktail tablet | Roche | 4693159001 | |
| Sodium dodecyl sulfate | ThermoFisher Scientific | 28364 | 20% (w/v) |
| Spectrophotometer (Nanodrop) | ThermoFisher Scientific | ND-2000 | |
| STAGE tipping centrifuge | Sonation | STC-V2 | |
| Thermal Shaker | VWR | NO89232-908 | |
| Trifluoroacetic acid | ThermoFisher Scientific | 85183 | |
| Trypsin/Lys-C protease mix, MS grade | Pierce | A40007 | Maintain at -20 °C. |
| Ultrasonic bath | Bransonic | A89375-450 | Stored in cold room (4C) |
| Urea | Sigma Aldrich | U1250-1KG | Prepare 40 mM HEPES/8 M Urea in bulk stock solution, flash frozen, store at -20 °C until use. Discard after each use (do not freeze-thaw repeatedly). |
| Yeast-extract peptone dextrose broth | BD Difco | BM20 |
References
- Bongomin, F., Gago, S., Oladele, R., Denning, D. Global and Multi-National Prevalence of Fungal Diseases-Estimate Precision. Journal of Fungi. , (2017).
- Tugume, L., et al. HIV-Associated cryptococcal meningitis occurring at relatively higher CD4 counts. Journal of Infectious Diseases. 219 (6), 877-883 (2019).
- Rajasingham, R., et al. Global burden of disease of HIV-associated cryptococcal meningitis: an updated analysis. The Lancet Infectious Diseases. , (2017).
- Perfect, J. R. The antifungal pipeline: A reality check. Nature Reviews Drug Discovery. , (2017).
- Bermas, A., Geddes-McAlister, J. Combatting the evolution of anti-fungal resistance in Cryptococcus neoformans. Molecular Microbiology. , 1-14 (2020).
- Geddes-McAlister, J., Shapiro, R. S. New pathogens, new tricks: Emerging, drug-resistant fungal pathogens and future prospects for antifungal therapeutics. Annals of the New York Academy of Sciences. , (2018).
- Ball, B., Bermas, A., Carruthers-Lay, D., Geddes-McAlister, J. Mass Spectrometry-Based Proteomics of Fungal Pathogenesis, Host-Fungal Interactions, and Antifungal Development. Journal of Fungi. , (2019).
- Sukumaran, A., et al. Decoding communication patterns of the innate immune system by quantitative proteomics. J Leukocyte Biol. , (2019).
- Salas, D., Stacey, R. G., Akinlaja, M., Foster, L. J. Next-generation interactomics: Considerations for the use of co-elution to measure protein interaction networks. Molecular and Cellular Proteomics. , (2020).
- Aebersold, R., Mann, M. Mass-spectrometric exploration of proteome structure and function. Nature. 537 (7620), 347-355 (2016).
- Mann, M., Kulak, N. A., Nagaraj, N., Cox, J. The Coming Age of Complete, Accurate, and Ubiquitous Proteomes. Molecular Cell. 49 (4), 583-590 (2013).
- Cox, J., et al. Accurate Proteome-wide Label-free Quantification by Delayed Normalization and Maximal Peptide Ratio Extraction, Termed MaxLFQ. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (9), 2513-2526 (2014).
- Ankney, J. A., Muneer, A., Chen, X. Relative and Absolute Quantitation in Mass Spectrometry-Based Proteomics. Annual Review of Analytical Chemistry. , (2018).
- Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).
- Tyanova, S., et al. The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data. Nature Methods. 13 (9), 731-740 (2016).
- Cox, J., et al. Andromeda: A peptide search engine integrated into the MaxQuant environment. Journal of Proteome Research. , (2011).
- Zhong, Z., Pirofski, L. A. Opsonization of Cryptococcus neoformans by human anticryptococcal glucuronoxylomannan antibodies. Infection and Immunity. , (1996).
- Nicola, A. M., et al. Macrophage autophagy in immunity to Cryptococcus neoformans and Candida albicans. Infection and Immunity. , (2012).
- Ball, B., Geddes-McAlister, J. Quantitative Proteomic Profiling of Cryptococcus neoformans. Current Protocols in Microbiology. , (2019).
- Geddes-McAlister, J., Gadjeva, M. Mass spectromerty-based quantitative proteomics of murine-derived polymorphonuclear neutrophils. Current Protocols in Immunology. , (2019).
- Geddes, J. M. H., et al. Secretome profiling of Cryptococcus neoformans reveals regulation of a subset of virulence-associated proteins and potential biomarkers by protein kinase A. BMC Microbiology. , (2015).
- Geddes, J. M. H., et al. Analysis of the protein kinase a-regulated proteome of Cryptococcus neoformans identifies a role for the ubiquitin-proteasome pathway in capsule formation. mBio. 7 (1), 1-15 (2016).
- Al Shweiki, M. H. D. R., et al. Assessment of Label-Free Quantification in Discovery Proteomics and Impact of Technological Factors and Natural Variability of Protein Abundance. Journal of Proteome Research. , (2017).
- Ong, S. E. Stable Isotope Labeling by Amino Acids in Cell Culture, SILAC, as a Simple and Accurate Approach to Expression Proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).
- Thompson, A., et al. Tandem mass tags: A novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS. Analytical Chemistry. 75 (8), 1895-1904 (2003).
- Borner, G. H. H. Organellar Maps Through Proteomic Profiling – A Conceptual Guide. Molecular & Cellular Proteomics. , (2020).
- Gingras, A. C., Abe, K. T., Raught, B. Getting to know the neighborhood: using proximity-dependent biotinylation to characterize protein complexes and map organelles. Current Opinion in Chemical Biology. , (2019).
- Kugadas, A., et al. Frontline Science: Employing enzymatic treatment options for management of ocular biofilm-based infections. Journal of Leukocyte Biology. , (2019).
- Yeung, J., Gadjeva, M., Geddes-McAlister, J. Label-Free Quantitative Proteomics Distinguishes General and Site-Specific Host Responses to Pseudomonas aeruginosa Infection at the Ocular Surface. Proteomics. , (2020).
- Yeung, J., Lamb, J., Krieger, J. R., Gadjeva, M., Geddes-McAlister, J. Quantitative Proteomic Profiling ofMurine Ocular Tissue and theExtracellular Environment. Current Protocols in Mouse Biology. 10 (83), (2020).
