Keşif Odaklı Konak-Patojen Etkileşimleri için Etiketsiz Nicel Proteomik İş Akışı
Summary
Burada, kitle spektrometresi bazlı proteomik enfeksiyon sırasında konak ve patojen arasındaki etkileşimin profilini çıkarmak için bir protokol sunuyoruz. Bu protokol, tek bir deneyde hem konakçının (örneğin, makrofajlar) hem de patojenin (örneğin Cryptococcus neoformans)protein bolluğundaki değişiklikleri ölçmek için etiketsiz niceleme kullanır.
Abstract
Kütle spektrometresinin (MS) teknolojik başarıları, bir organizmanın küresel proteomunu değişen koşullar altında analiz etmek için keşfedilmemiş birçok yol açar. Mikrobiyal patojenlerin istenen konak ile etkileşimlerine uygulanan bu güçlü strateji, her iki bakış açısını da enfeksiyona karşı kapsamlı bir şekilde karakterize eder. Burada, iş akışı, ölümsüzleştirilmiş makrofaj hücrelerinin varlığında ölümcül hastalık kriptokokokozun etken maddesi olan mantar öğretim üyesi hücre içi patojen Cryptococcus neoformans’ın enfektomunun etiketsiz nicelemesini (LFQ) açıklar. Protokol, tek bir deneyde hem patojen hem de memeli hücreleri için uygun protein hazırlama tekniklerini detaylandırıyor ve bu da sıvı kromatografisi (LC)-MS/MS analizi için uygun peptit gönderimi ile sonuç veriyor. LFQ’nun yüksek verimli jenerik doğası, çok çeşitli protein tanımlama ve nicelemenin yanı sıra herhangi bir konak-patojen enfeksiyon ayarına aktarılabilmesini sağlar ve aşırı hassasiyeti korur. Yöntem, enfeksiyon taklit eden koşullarda bir patojenin kapsamlı, tarafsız protein bolluk profillerini kataloglamak için optimize edilmiştir. Özellikle, burada gösterilen yöntem, virülans için gerekli protein üretimi gibi C. neoformans patogenez hakkında temel bilgiler sağlar ve mikrobiyal istilaya yanıt veren kritik konak proteinleri tanımlar.
Introduction
İnvaziv mantar enfeksiyonlarının prevalansı büyük ölçüde artmaktadır ve en sık immün yetmezlik yatkınlığı olan bireylerde bildirilen kabul edilemez yüksek ölüm oranları ile ilişkilidir1. Cryptococcus neoformans, konak makrofaj hücrelerinde hücre içi sağkalım yapabilen ünlü bir fırsatçı mantar patojenidir. Yetersiz antifungal müdahale, kriptokoksal menenjit ve meningoensefalit2,3mantar yayılması ve hayatı tehdit eden belirtilerle sonuçlanır. İmmün sistemi baskılanmış statüdeki küresel artış, C. neoformanlar da dahil olmak üzere birçok mantar türünün4,5,6’yadoğru giderek daha fazla direnç geliştirdiği antifungal ajanların kullanımında paralel bir artış talep etti. Bu nedenle, konak savunma yanıtı ve mikrobiyal patogenez ile ilgili hayati biyolojik soruları yanıtlamak için sağlam ve verimli teknolojilerin uygulanması zorunludur.
Güçlü hesaplamalı ve biyoinformatik boru hatlarının üretimi de dahil olmak üzere kütle spektrometresinde (MS) teknolojik ilerlemenin yeni çağı, konak-patojen araştırmalarının büyük ölçekli analizi için bütünleştirici bir vizyon için temel sağlar7,8. Konvansiyonel patogenez odaklı proteomik analiz, protein korelasyon profilleme, proteomik ile birlikte benzeşim kromatografisi ve interactomik9gibi kapsamlı metodolojiler de dahil olmak üzere, enfeksiyonun ana bilgisayar veya patojen perspektifinden görünümünü yaygın olarak profiller. Konak bir sistemde tehlikeli patojenlerin virülansına yönelik araştırmalar çok büyük klinik öneme sahiptir; ancak, tek bir deneyde çift perspektif analizinin uygulanması daha önce ulaşılamaz olarak kabul edildi. Örneğin, patojenin enfeksiyona bakış açısı genellikle çok bol konak proteinleri tarafından boğulmuştur ve bu da düşük bol mantar proteinlerinin tespiti için daha az hassasiyetle sonuçlanır7. Ayrıca, yüksek örnek karmaşıklığı birçok hedefi tek bir deneysel sistemde araştırmaya davet eder ve belirli bir patojen proteini için etki mekanizmalarını aydınlatmaya zor olduğunu kanıtlamaktadır.
Aşağıdan yukarıya proteomik, peptitlerin diziye özgü enzmatik sindirim ve ardından MS10 , 11ile sıvı kromatografi ayırma, tanımlama ve niceleme ile üretildiği yönetilebilir numune hazırlamayı sağlayan popüler bir MS tekniğidir. Burada, enfeksiyon bazlı bir proteom veya ‘infectome’nin tarafsız bir kapsamını elde etmeyi amaçlayan veriye bağımlı bir satın alma stratejisini gösteren bir yöntem sunuyoruz. Özellikle, etiketsiz niceleme (LFQ), birden fazla proteomdaki protein seviyesi değişikliklerinin sağlam ve doğru tanımlanması için kimyasal veya metabolik etiketlere bağımlılığı azaltır, numune işleme ve işlemeadımlarını azaltır 12,13. Bu evrensel uygulama, beklenen herhangi bir protein üretiminden bağımsız bir hücre içinde belirli bir anda üretilen proteinleri sorgular; bu nedenle, enfeksiyon için kritik olan yeni içgörüler keşfedilebilir.
Burada açıklanan iş akışı, konak bağışıklık hücreleri ile enfeksiyon taklit etme koşulları sırasında C. neoformanların protein seviyesi değişikliklerini araştırmak için optimize edilmiştir (Şekil 1). Hücre tiplerinin izolasyonu ve ayrılmasına güvenmek yerine, bu yaklaşım konak ve patojen proteomlarını birlikte çıkarır ve türe özgü protein üretimini ayırt etmek için organizmaya özgü iki veritabanı kullanarak biyoinformatik ayırmayı kullanır. Bu yöntem, izotop bazlı etiketleme çalışmalarında veya fraksiyonasyonda gerekli olan ekstra maliyetli hazırlık adımları olmadan sınırsız sayıda numunenin işlenmesi için avantajlar sunar. Ayrıca, bu iş akışı, konak bağışıklık hücrelerini hedefleyebilen ve enfekte edebilen çok çeşitli mantar ve bakteriyel patojenlere aktarılabilen optimize edilmiş protein ekstraksiyon protokollerini desteklemektedir. Genel olarak, bu protokol, yüksek çözünürlüklü MS için tarafsız bir protein ekstraksiyonu ve numune işlemeyi tamamlama adımlarını ve ardından, konak savunma yanıtının kapsamlı profillemesiyle birlikte enfeksiyon için önemli mantar proteinleri hakkında zengin bir bilgi sağlayabilen veri ve istatistiksel analizi özetlemektedir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokoldeki kritik adımlar arasında makrofaj hücrelerinin hazırlanması ve hücrelerde minimum bozulma ile protein işleme için ortak kültür örneklerinin toplanması yer almaktadır. Toplamadan önce hücrelerin gereksiz lizizini önlemek için yapışkan makrofaj hücrelerini hafifçe ve dikkatlice yıkama, aşılama ve çıkarma adımlarını gerçekleştirmek önemlidir. Deney için doğru MOI’nin oluşturulması da kritik öneme sahiptir, çünkü aşırı yüksek bir MOI ile aşılamak hızlı makrofaj hüc…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, temsili deneyler için kütle spektrometresini çalıştırdıkları için Bioinformatics Solutions Inc.’den Dr. Jonathan Krieger’e ve deneysel kurulum ve el yazması geri bildirimlerine yardımcı olan Geddes-McAlister grubunun üyelerine teşekkür ediyor. Yazarlar, kısmen Banting Araştırma Vakfı’ndan – Jarislowsky Burs Keşif Ödülü’ nden fon desteğini kabul ediyorlar, New Frontiers Araştırma Fonu – Keşif (NFRFE-2019-00425) ve J.G..M için Kanada İnovasyon Vakfı (JELF 38798) yanı sıra NSERC Kanada Lisansüstü Bursu – Yüksek Lisans ve Ontario Yüksek Lisans Bursu B.B.
Materials
| 100 mM Tris-HCl, pH 8.5 | Fisher Scientific | BP152-1 | Maintain at 4°C |
| 60 x 15 mm Dish, Nunclon Delta | ThermoFisher Scientific | 174888 | |
| 6-well cell culture plate | ThermoFisher Scientific | 140675 | |
| Acetonitrile, MS grade | Pierce | TS-51101 | |
| Acetic Acid | Sigma Aldrich | 1099510001 | |
| Acetone | Sigma Aldrich | 34850-1L | |
| Ammonium bicarbonate (ABC) | ThermoFisher Scientific | A643-500 | Prepare a stock 50 mM ABC solution, stable at room temperature for up to one month. |
| Bel-Art™ HiFlow Vacuum Aspirator Collection System | Fisher Scientific | 13-717-300 | Not essential, serological pipettes can be used to remove media. |
| C18 resin | 3M Empore | 3M2215 | |
| Cell Scrapers | VWR | 10062-906 | Not essential, other methods to release macrophage cells can be used. |
| Centrifugal vaccuum concentrator | Eppendorf | 07-748-15 | |
| Complete Filtration Unit | VWR | 10040-436 | |
| Conical falcon tubes (15 mL) | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
| Countess II Automated Cell Counter | ThermoFisher Scientific | AMQAX1000 | Not essential, haemocytometer can be used as an alternative. |
| CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay | Promega | G1780 | |
| Dithiothreitol (DTT) | ThermoFisher Scientific | R0861 | Prepare bulk stock solution of 1 M DTT, flash frozen and stored at -20 °C until use. Discard after each use (do not freeze-thaw repeatedly). |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement | ThermoFisher Scientific | 10566016 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher Scientific | 12483020 | Heat inactivate by incubating at 60°C for 30 minutes. Prepare 50 ml aliquots and flash freeze. Thaw prior to media preparation |
| Haemocytometer | VWR | 15170-208 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | Prepare 40 mM HEPES/8 M Urea in bulk stock solution, flash frozen, store at -20°C until use. Discard after each use (do not freeze-thaw repeatedly). |
| High-performance liquid chromatography system | ThermoFisher Scientific | LC140 | Gradient length is based on sample complexity, recommended 120 min gradient for infectome samples. |
| High-resolution mass spectrometer | ThermoFisher Scientific | 726042 | |
| Iodoacetamide (IAA) | Sigma Aldrich | I6125 | Prepare 0.55 M bulk stock solution, flash frozen, store at -20°C until use. Discard after each use (do not freeze-thaw repeatedly). |
| L-glutamine | ThermoFisher Scientific | 25030081 | Can be aliquot and frozen for storage. Thaw prior to media preparation. |
| LoBind Microcentrifuge tubes | Eppendorf | 13-698-794 | |
| MaxQuant | https://maxquant.org/ | MaxQuant is a public platform that offers tutorials, such as the MaxQuant Summer School, outlining the computational analysis steps of large MS data sets | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 13864457 | |
| Penicillin : Streptomycin 10k/10k | VWR | CA12001-692 | Can be aliquot and frozen for storage. Thaw prior to media preparation. |
| Peptide separation columns | ThermoFisher Scientific | ES803 | |
| Perseus Software | http://maxquant.net/perseus/ | ||
| Phosphate Buffered Saline | VWR | CA12001-676 | Puchase not required. PBS can also be prepared but sterile filteration must be performed before use. |
| Pierce BCA Protein Assay | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
| Pipette, Disposable Serological (10 mL) | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
| Pipette, Disposable Serological (25 mL) Basix | Fisher Scientific | 14955235 | |
| Probe sonciator | ThermoFisher Scientific | 100-132-894 | |
| Protease inhibitor cocktail tablet | Roche | 4693159001 | |
| Sodium dodecyl sulfate | ThermoFisher Scientific | 28364 | 20% (w/v) |
| Spectrophotometer (Nanodrop) | ThermoFisher Scientific | ND-2000 | |
| STAGE tipping centrifuge | Sonation | STC-V2 | |
| Thermal Shaker | VWR | NO89232-908 | |
| Trifluoroacetic acid | ThermoFisher Scientific | 85183 | |
| Trypsin/Lys-C protease mix, MS grade | Pierce | A40007 | Maintain at -20 °C. |
| Ultrasonic bath | Bransonic | A89375-450 | Stored in cold room (4C) |
| Urea | Sigma Aldrich | U1250-1KG | Prepare 40 mM HEPES/8 M Urea in bulk stock solution, flash frozen, store at -20 °C until use. Discard after each use (do not freeze-thaw repeatedly). |
| Yeast-extract peptone dextrose broth | BD Difco | BM20 |
References
- Bongomin, F., Gago, S., Oladele, R., Denning, D. Global and Multi-National Prevalence of Fungal Diseases-Estimate Precision. Journal of Fungi. , (2017).
- Tugume, L., et al. HIV-Associated cryptococcal meningitis occurring at relatively higher CD4 counts. Journal of Infectious Diseases. 219 (6), 877-883 (2019).
- Rajasingham, R., et al. Global burden of disease of HIV-associated cryptococcal meningitis: an updated analysis. The Lancet Infectious Diseases. , (2017).
- Perfect, J. R. The antifungal pipeline: A reality check. Nature Reviews Drug Discovery. , (2017).
- Bermas, A., Geddes-McAlister, J. Combatting the evolution of anti-fungal resistance in Cryptococcus neoformans. Molecular Microbiology. , 1-14 (2020).
- Geddes-McAlister, J., Shapiro, R. S. New pathogens, new tricks: Emerging, drug-resistant fungal pathogens and future prospects for antifungal therapeutics. Annals of the New York Academy of Sciences. , (2018).
- Ball, B., Bermas, A., Carruthers-Lay, D., Geddes-McAlister, J. Mass Spectrometry-Based Proteomics of Fungal Pathogenesis, Host-Fungal Interactions, and Antifungal Development. Journal of Fungi. , (2019).
- Sukumaran, A., et al. Decoding communication patterns of the innate immune system by quantitative proteomics. J Leukocyte Biol. , (2019).
- Salas, D., Stacey, R. G., Akinlaja, M., Foster, L. J. Next-generation interactomics: Considerations for the use of co-elution to measure protein interaction networks. Molecular and Cellular Proteomics. , (2020).
- Aebersold, R., Mann, M. Mass-spectrometric exploration of proteome structure and function. Nature. 537 (7620), 347-355 (2016).
- Mann, M., Kulak, N. A., Nagaraj, N., Cox, J. The Coming Age of Complete, Accurate, and Ubiquitous Proteomes. Molecular Cell. 49 (4), 583-590 (2013).
- Cox, J., et al. Accurate Proteome-wide Label-free Quantification by Delayed Normalization and Maximal Peptide Ratio Extraction, Termed MaxLFQ. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (9), 2513-2526 (2014).
- Ankney, J. A., Muneer, A., Chen, X. Relative and Absolute Quantitation in Mass Spectrometry-Based Proteomics. Annual Review of Analytical Chemistry. , (2018).
- Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).
- Tyanova, S., et al. The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data. Nature Methods. 13 (9), 731-740 (2016).
- Cox, J., et al. Andromeda: A peptide search engine integrated into the MaxQuant environment. Journal of Proteome Research. , (2011).
- Zhong, Z., Pirofski, L. A. Opsonization of Cryptococcus neoformans by human anticryptococcal glucuronoxylomannan antibodies. Infection and Immunity. , (1996).
- Nicola, A. M., et al. Macrophage autophagy in immunity to Cryptococcus neoformans and Candida albicans. Infection and Immunity. , (2012).
- Ball, B., Geddes-McAlister, J. Quantitative Proteomic Profiling of Cryptococcus neoformans. Current Protocols in Microbiology. , (2019).
- Geddes-McAlister, J., Gadjeva, M. Mass spectromerty-based quantitative proteomics of murine-derived polymorphonuclear neutrophils. Current Protocols in Immunology. , (2019).
- Geddes, J. M. H., et al. Secretome profiling of Cryptococcus neoformans reveals regulation of a subset of virulence-associated proteins and potential biomarkers by protein kinase A. BMC Microbiology. , (2015).
- Geddes, J. M. H., et al. Analysis of the protein kinase a-regulated proteome of Cryptococcus neoformans identifies a role for the ubiquitin-proteasome pathway in capsule formation. mBio. 7 (1), 1-15 (2016).
- Al Shweiki, M. H. D. R., et al. Assessment of Label-Free Quantification in Discovery Proteomics and Impact of Technological Factors and Natural Variability of Protein Abundance. Journal of Proteome Research. , (2017).
- Ong, S. E. Stable Isotope Labeling by Amino Acids in Cell Culture, SILAC, as a Simple and Accurate Approach to Expression Proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).
- Thompson, A., et al. Tandem mass tags: A novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS. Analytical Chemistry. 75 (8), 1895-1904 (2003).
- Borner, G. H. H. Organellar Maps Through Proteomic Profiling – A Conceptual Guide. Molecular & Cellular Proteomics. , (2020).
- Gingras, A. C., Abe, K. T., Raught, B. Getting to know the neighborhood: using proximity-dependent biotinylation to characterize protein complexes and map organelles. Current Opinion in Chemical Biology. , (2019).
- Kugadas, A., et al. Frontline Science: Employing enzymatic treatment options for management of ocular biofilm-based infections. Journal of Leukocyte Biology. , (2019).
- Yeung, J., Gadjeva, M., Geddes-McAlister, J. Label-Free Quantitative Proteomics Distinguishes General and Site-Specific Host Responses to Pseudomonas aeruginosa Infection at the Ocular Surface. Proteomics. , (2020).
- Yeung, J., Lamb, J., Krieger, J. R., Gadjeva, M., Geddes-McAlister, J. Quantitative Proteomic Profiling ofMurine Ocular Tissue and theExtracellular Environment. Current Protocols in Mouse Biology. 10 (83), (2020).
