Inyecciones pupales y para adultos para RNAi y edición de genes CRISPR en Nasonia vitripennis
Summary
Aquí, se describen los métodos para las inyecciones pupales y adultos eficientes en Nasonia vitripennis como alternativas accesibles a la microinyección embrionaria, lo que permite el análisis funcional de los genes de interés utilizando ya sea arn-silenciamiento a través de la interferencia de ARN (RNAi) o knockout gen a través de CRISPR / Cas9 edición del genoma.
Abstract
La avispa joya, Nasonia vitripennis,se ha convertido en un sistema modelo eficiente para estudiar la epigenética de la determinación del sexo haplo-diploide, la biología del cromosoma B, las interacciones huésped-simbionte, la especiación y la síntesis de veneno. A pesar de la disponibilidad de varias herramientas moleculares, incluyendo CRISPR/Cas9, los estudios genéticos funcionales todavía son limitados en este organismo. La principal limitación de la aplicación de la tecnología CRISPR/Cas9 en N. vitripennis se deriva de los desafíos de las microinyecciones embrionarias. Las inyecciones de embriones son particularmente difíciles en este organismo y en general en muchas avispas parasitoides, debido al pequeño tamaño del embrión y el requisito de una pupa huésped para el desarrollo embrionario. Para abordar estos desafíos, se optimizó la entrega del complejo de ribonucleoproteína Cas9 en los ovarios femeninos por inyección adulta, en lugar de microinyección embrionaria, lo que resultó en ediciones de línea germinal somáticas y heredables. Los procedimientos de inyección se optimizaron en pupas y avispas hembras utilizando ReMOT Control (Receptor-Mediated Ovary Transduction of Cargo) o BAPC (Branched Amphiphilic Peptide Capsules). Estos métodos han demostrado ser alternativas eficaces a la inyección de embriones, lo que permite mutaciones de la línea germinal hereditarias y específicas del sitio.
Introduction
La edición de genes CRISPR/Cas9 es una poderosa tecnología para estudios genéticos funcionales, especialmente en muchos organismos modelo ascendentes como la avispa joya, Nasonia vitripennis. La facilidad de cría y la disponibilidad de un genoma completo hacen de la avispa joya un importante sistema experimental para dilucidar los mecanismos moleculares de diferentes procesos biológicos. Por ejemplo, N. vitripennis se ha utilizado recientemente para desentrañar la base epigenética del sistema de determinación de sexo haplodiploide1,2,la biología de los cromosomas B3,4,5,6,y la base genética para la regulación circadiana y estacional7,8. Algunas de las características que hacen que N. vitripennis sea susceptible de trabajar incluyen un corto tiempo de generación (~ 2 semanas a 25 ° C), altas tasas de reproducción, fácil separación sexual en la etapa pupal y la capacidad de diapausa y almacenar cepas a 4 ° C. El ciclo de vida comienza con las avispas hembras parasitando las pupas de la luciérnga, Sarcophaga bullata. A través de su ovipositor, las hembras ponen hasta 50 huevos en el caso pupal de la 8ra. Los huevos se convierten en larvas que se alimentan de la pupa de S. bullata, continúan desarrollándose durante los próximos días, y luego pupan, seguidos de eclosión adulta y la aparición del pupario huésped9.
Se dispone de herramientas moleculares para realizar estudios genéticos funcionales en N. vitripennis,tales como la interferencia de ARN (ARNi)10 y CRISPR/Cas911,12,pero son limitadas, principalmente debido a las dificultades en la realización de microinyecciones embrionarias13. Como los huevos de N. vitripennis requieren un huésped pupal para el desarrollo, la manipulación de huevos es muy difícil. Los embriones en etapa pre-blastodermo deben ser recolectados de las pupas de la luciérnga del huésped, microinyectados rápidamente y transferidos inmediatamente de vuelta al huésped para su desarrollo13. Estos pasos requieren precisión y entrenamiento especializado para evitar dañar los embriones microinyectados o los hospedadores pupales13. Además, los óvulos son muy pequeños y frágiles, especialmente después de microinyecciones, con un citoplasma muy viscoso que provoca una obstrucción continua de la aguja de inyección13. Estas características hacen que las microinyecciones embrionarias sean excepcionalmente desafiantes, requiriendo operadores altamente capacitados y equipos especializados que están ausentes en la mayoría de los laboratorios de N. vitripennis.
La optimización de métodos alternativos de inyección para la administración de reactivos CRISPR contribuiría a la consolidación de N. vitripennis como organismo modelo. La manipulación de pupas y adultos es menos difícil que la manipulación de embriones y se puede lograr con una configuración básica de inyección. Aquí, dos protocolos se describen para la inyección de pupas y adultos: uno que implica el equipo especializado para las inyecciones, y el otro que implica el uso de un conjunto del tubo del aspirador cabido con una aguja capilar de cristal. El uso de un tubo aspirador es particularmente adecuado para laboratorios que no tienen acceso a equipos especializados para microinyecciones de embriones. Se demuestran inyecciones eficientes de diferentes etapas de desarrollo de N. vitripennis,incluyendo pupas blancas o negras y avispas adultas. Las avispas en la etapa de pupa blanca son particularmente adecuadas para experimentos de derribo mediados por RNAi. Aunque RNAi en Nasonia fue descrito por primera vez por Lynch y Desplan en 200610, no hay ningún procedimiento visual disponible para cómo se realizan las inyecciones de RNAi. RNAi fue utilizado recientemente para descubrir el gen haploidizador del cromosoma B PSR (Paternal Sex Ratio)3 y para estudiar la implicación del gen reloj, período,en los ritmos biológicos de N. vitripennis 7.
Las pupas negras y las avispas adultas se pueden utilizar para inducir la edición de genes de línea germinal CRISPR/Cas9 utilizando los protocolos ReMOT Control (Receptor-Mediated Ovary Transduction of Cargo) y BAPC (Branched Amphiphilic Peptide Capsules). Estos dos métodos de administración de ovarios se han descrito recientemente como eficaces en Nasonia para generar mutaciones en la línea germinal en el gen diana, el cinabrio7,12. Aquí, se proporciona un protocolo simplificado para las inyecciones que incluye un procedimiento visual de una metodología paso a paso para inyecciones pupales y adultas que se pueden utilizar para generar estudios de genética funcional en Nasonia y probablemente en otras avispas parasitoides, sin requerir equipo especializado y evitando microinyecciones embrionarias.
Protocol
Representative Results
Discussion
Con el reciente aumento del uso de Nasonia vitripennis como organismo modelo para diversas cuestiones biológicas2,3,7,17,existe la necesidad de desarrollar y optimizar los métodos de inyección para permitir un protocolo simplificado y eficiente para el análisis funcional de los genes de N. vitripennis. Los métodos actuales que involucran la microinyección embrionaria de …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado en parte por los fondos de inicio de UCSD dirigidos a O.S.A. y NSF / BIO 1645331 de subvenciones a J.L.R.
Materials
| 100 x 15 mm Stackable Petri Dishes, Polystyrene, Mono, Sterile | Sigma | 960-97693-083 | |
| Aluminosilicate glass capillary tubing 1 mm(outside diameter) x 0.58 mm (inner diameter) | Sutter Instruments | BF100-58-10 | Can also use Borosilicate or Quartz |
| Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes | Sigma | A5177-5EA | |
| BAPC | phoreus biotech | BAPtofect-25 0.5 mg Kit | |
| Cas9 Protein with NLS | PNABio | CP01 | |
| Dissecting needle | VWR | 10806-330 | |
| DNase/RNase-Free distilled Water | Invitrogen | 10977-015 | |
| Femtojet Express programmable microinjector | Eppendorf | ||
| Femtotips Microloader tips | Fisher Scientific | E5242956003 | |
| Fine-tip paintbrush | ZEM | 2595 | |
| Flesh fly pupae, Sarcophaga bullata | Ward's Science | 470180-392 | |
| Food colorant dye | |||
| Glass Test Tubes | Fisher Scientific | 982010 | |
| Glue | Elmer's | washable, no toxic school glue | |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-1000 or P-2000 | |
| Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-A3 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ51 |
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