קביעת דרישות האבקה בשזיף היפני על ידי ניטור פנולוגי, האבקות ביד, מיקרוסקופיה פלואורסצנטית וגנוטיפינג מולקולרי
Summary
מתודולוגיה לקביעת דרישות האבקה בהיברידיות מסוג שזיף יפני מתוארת, המשלבת האבקות שדה ומעבדות ותצפיות של צינורות אבקה תחת מיקרוסקופיית פלואורסצנטיות עם זיהוי של S-genotypes על ידי PCR וניטור הפריחה לבחירת מאביקים.
Abstract
פולחן השזיפים היפני שגודל בדרך כלל הוא בני כלאיים בין-מיניים שמקורם בצלבים בין סליצ’ינה פרונוס המקורית לבין מינים אחרים של פרונוס. רוב ההיברידים מפגינים אי-תאימות עצמית משחקטופיטית, הנשלטת על ידי S-לוקוס יחיד ופולימורפי מאוד המכיל אללים מרובים. רוב ההיברידים המעובדים אינם תואמים את עצמם וצריכים אבקה מתורם תואם כדי להפרות את הפרחים שלהם. קביעת דרישות האבקה בשזיף היפני הופכת חשובה יותר ויותר בשל המספר הגבוה של cultivars חדשים עם דרישות האבקה לא ידועות. בעבודה זו, מתודולוגיה לקביעת דרישות האבקה בהיברידיות מסוג שזיף יפני מתוארת. התאימות העצמית נקבעת על ידי האבקות ידניות הן בתחום והן במעבדה, ולאחר מכן ניטור התארכות צינור האבקה באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, וגם ניטור התבגרות פירות בתחום. מבחר של cultivars מאביקים מוערך על ידי שילוב זיהוי של S-genotypes על ידי ניתוח PCR עם ניטור של זמן פריחה בתחום. הכרת דרישות ההאבקה של cultivars מקלה על בחירת cultivars לעיצוב פרדסים חדשים ומאפשרת גילוי מוקדם של בעיות פרודוקטיביות הקשורות עם חוסר האבקה בפרדסים מבוססים.
Introduction
שזיף יפני(פרונוס סליצילינה לינדל) הוא יליד סין1. במאה ה -19, יבול זה הוצג מיפן לארצות הברית, שם הוא היה שזור עם שזיפים דיפלואידים אחרים בצפון אמריקה2. במאהה-20, חלק מההיברידים האלה התפשטו לאזורים ממוזגים ברחבי העולם. כיום, המונח “שזיף יפני” מתייחס למגוון רחב של היברידיות בין-מיניות שמקורן בצלבים בין P. salicina המקורי עם עד 15 פרונוס דיפלואידים אחרים עמ‘3,4,5.
שזיף יפני, כמו מינים אחרים של משפחת Rosaceae, מציג Gametophytic עצמית אי תאימות (GSI), אשר נשלט על ידי אחד מאוד polymorphic S– לוקוס המכיל אללים מרובים6. ה- S-לוקוסמכיל שני גנים המקודדים ריבונוקלאז(S-RNase)המתבטא בפסטיל, וחלבון F-box (SFB) המתבטא בגרגר האבקה7. בתגובת אי הכשירות העצמית, כאשר S-allele לידי ביטוי גרגר האבקה (הפלואיד) זהה לאחד מהשניים המבוטאים ב pistil (diploid), הצמיחה של צינור האבקה על פני הסגנון נעצר עקב השפלה של צינור האבקה RNA על ידי הפעולה של S-RNase8. מאז תהליך זה מונע הפריה של gametophyte הנשי בovule, GSI מקדם את outcrossing בין cultivars.
למרות שחלק מכת השזיפים היפנית תואמת את עצמה, רוב הפולחנים הגדלים כיום אינם תואמים את עצמם, והם זקוקים לאבקה מתורמים בין-תואמים כדי להפרות את הפרחים שלהם3. במיני פרי אבן מסוג פרונוס כגוןשקדים 9, משמש10,11,12 ודובדבן מתוק13, דרישות האבקה של cultivars ניתן לקבוע על ידי גישות שונות. תאימות עצמית (in) יכולה להיקבע על ידי האבקה עצמית של פרחים בשטח וניטור לאחר מכן של ערכת פירות, או על ידי האבקה עצמית של חצי ויוו בתנאים מבוקרים במעבדה ותצפית של צינורות אבקה מתחת למיקרוסקופ14,15,16,17,18 . יחסי אי התאמה בין cultivars ניתן לקבוע על ידי האבקות צולבות בתחום או במעבדה באמצעות אבקה של cultivar מאביקים פוטנציאליים, ועל ידי זיהוי S-alleles של כל cultivar על ידי ניתוח PCR14,15,16,19,20,21,22 . במינים כגון דובדבן מתוק או שקדים, התאימות העצמית (in)ניתן להעריך גם על ידי זיהוי של אלס S מסוים הקשורים לתאימות עצמית, כמו S4‘ בדובדבן מתוק13 או Sf בשקדים23.
מספר תוכניות גידול שזיפים מהמדינות המייצרות העיקריות משחררות מספר cultivarsחדשים 2,14, רבים מהם עם דרישות האבקה לא ידועות. בעבודה זו, מתודולוגיה לקביעת דרישות האבקה בהיברידיות מסוג שזיף יפני מתוארת. תאימות עצמית נקבעת על ידי האבקה עצמית הן בתחום והן במעבדה, ואחריהן תצפיות של צינורות אבקה תחת מיקרוסקופיית הפלואורסצנטיות. מבחר של cultivars מאביקים משלב את הזיהוי של S-genotypes על ידי ניתוח PCR עם ניטור של זמן פריחה בתחום.
Protocol
Representative Results
Discussion
המתודולוגיה המתוארת כאן לדרישות האבקה של פולחנים שזיפים יפניים דורשת קביעת התאימות העצמית של כל כת על ידי האבקות מבוקרות בתחום או במעבדה, ותצפית לאחר מכן של צמיחת צינור אבקה עם מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. מערכות היחסים של אי-תאימות נוצרות על ידי אפיון של S-alleles על ידי genotyping מולקולרי. לב?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה מומן על ידי המכון הלאומי לחקר y Tecnología אגריה y Alimentaria (RFP2015-00015-00 ו RTA2017-00003-00); Gobierno de Aragón – הקרן החברתית האירופית, האיחוד האירופי (Grupo Consolidado A12-17R) ו חונטה דה אקסטרמדורה — פונדו אירופה דה דסארולו אזורי (FEDER), Plan Regional de Investigación (IB16181), Grupo de Investigación (AGA001, GR18196). B.I. Guerrero נתמך על ידי מלגה של Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología של מקסיקו (CONACYT, 471839).
Materials
| Acetic Acid Glacial | Panreac | 131008.1611 | |
| Agar | iNtRON Biotechnology | 25999 | |
| Aniline blue | Difco | 8504-88 | |
| Boric Acid (H3BO4) | Panreac | 131015.1210 | |
| Calcium Nitrate 4-hydrate (Ca(NO3)2·4H2O) | Panreac | 131231.1211 | |
| Coverglass | Deltalab | D102460 | 24 mm x 60 mm |
| Digital Camera | Imaging Developmet Systems | UI-1490SE | |
| Digital Camera Software Suite | Imaging Developmet Systems | 4.93.0. | |
| DNA Oligos | ThermoFisher Scientific | ||
| dNTP Mix, 10 mM each | ThermoSischer Scientific | R0193 | |
| DreamTaq Green DNA polymerase | ThermoFisher Scientific | EP0713 | |
| Ethanol 96° | VWR-Chemicals | 83804.360 | |
| 1Kb DNA Ladder (U.S. Patent No. 4.403.036) (500pb-12Kb) | Invitrogen | 15615-016 | Size: 250µg; Conc: 1.0 µg/µl |
| Gel Documentation System | Bio-Rad | 1708195 | |
| Hand Counter | Tamaco | TM-4 | |
| Image Lab Software | Bio-Rad | Image Analyse System for Gel Documentation System | |
| MetaPhor Agarose | Lonza | 50180 | |
| Microcentrifuge 5415 R | Eppendorf | Z605212 | |
| Microscope with UV epiflurescence | Leica | DM2500 | Exciter filter BP340-390, Barrier filter LP425 |
| Microslides | Deltalab | D100004 | 26 mm x 76 mm |
| Mini Electrophoresis System | Fisherbrand | 14955170 | |
| Minicentrifuge | ThermoFisher Scientific | 15334204 | |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND1000 | |
| Petri Dishes | Deltalab | 200201 | 55 mm x 14 mm |
| Potassium Phosphate Tribasic (K3PO4·1.5H2O) | Panreac | 141513 | |
| Primer forward 'Pru C2' | ThermoFisher Scientific | ||
| Primer forward Pru T2' | ThermoFisher Scientific | ||
| Primer reverse 'PCER' | ThermoFisher Scientific | ||
| RedSafe Nucleic Acid Staining Solution | iNtRON Biotechnology | 21141 | |
| Saccharose | Panreac | 131621.1211 | |
| Sodium sulphite anhydrous (Na2SO3) | Panreac | 131717.1211 | |
| Speedtools plant DNA extraction Kit | Biotools | 21272 | |
| TBE Buffer (10X) | Panreac | A0972,5000PE | |
| Thermal Cycler T100 | Bio-Rad | 1861096 | |
| Thermomixer comfort | Eppendorf | T1317 | |
| Vertical Autoclave Presoclave II | JP Selecta | 4001725 | |
| Vortex | Fisherbrand | 11746744 |
References
- Hendrick, U. P. . The Plums of New York. , (1911).
- Okie, W. R., Hancock, J. F., Hancock, J. F. Plums. Temperate Fruit Crop Breeding. , 337-357 (2008).
- Guerra, M. E., Rodrigo, J. Japanese plum pollination: a review. Scientia Horticulturae. 197, 674-686 (2015).
- Okie, W. R. Introgression of Prunus species in plum. New York Fruit Quarterly. 14 (1), 29-37 (2006).
- Okie, W. R., Weinberger, J. H., Janick, J., Moore, J. . Fruit Breeding, vol. 1. Tree and tropical fruits. , 559-608 (1996).
- Mccubbin, A. G., Kao, T. Molecular recognition and response in pollen and pistil interactions. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 16, 333-364 (2000).
- Hegedűs, A., Halász, J. Recent findings of the tree fruit self-incompatibility studies. International Journal of Horticultural Science. 13 (2), 7-15 (2007).
- de Nettancourt, D. . Incompatibility and Incongruity in Wild and Cultivated Plants. , (2001).
- Tao, R., et al. Identification of stylar RNases associated with gametophytic self-incompatibility in almond (Prunus dulcis). Plant and Cell Physiology. 38 (3), 304-311 (1997).
- Halász, J., Pedryc, A., Ercisli, S., Yilmaz, K., Hegedűs, A. S-genotyping supports the genetic relationships between Turkish and Hungarian apricot germplasm. Journal of the American Society for Horticultural Science. 135 (5), 410-417 (2010).
- Lora, J., Hormaza, J. I., Herrero, M., Rodrigo, J. Self-incompatibility and S-allele identification in new apricot cultivars. Acta Horticulturae. (1231), 171-176 (2019).
- Herrera, S., Lora, J., Hormaza, J. I., Rodrigo, J. Determination of self- and inter-(in)compatibility relationships in apricot combining hand-pollination, microscopy and genetic analyses. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (160), (2020).
- Cachi, A. M., Wunsch, A. Characterization of self-compatibility in sweet cherry varieties by crossing experiments and molecular genetic analysis. Tree Genetics & Genomes. 10, 1205-1212 (2014).
- Guerra, M. E., Guerrero, B. I., Casadomet, C., Rodrigo, J. Self-compatibility, S-RNase allele identification, and selection of pollinizers in new Japanese plum-type cultivars. Scientia Horticulturae. 261, 109022 (2020).
- Herrera, S., Lora, J., Hormaza, J. I., Herrero, M., Rodrigo, J. Optimizing production in the new generation of apricot cultivars: self-incompatibility, S-RNase allele identification, and incompatibility group assignment. Frontiers in Plant Science. 9, 1-12 (2018).
- Herrera, S., Rodrigo, J., Hormaza, J. I., Lora, J. Identification of self-incompatibility alleles by specific PCR analysis and S-RNase sequencing in apricot. International Journal of Molecular Sciences. 19 (11), 3612 (2018).
- Sociasi Company, R., Kodad, O., Fernández i Martí, J. M., Alonso, J. M. Mutations conferring self-compatibility in Prunus species: from deletions and insertions to epigenetic alterations. Scientia Horticulturae. 192, 125-131 (2015).
- Rodrigo, J., Herrero, M. Evaluation of pollination as the cause of erratic fruit set in apricot ‘Moniqui. Journal of Horticultural Science and Biotechnology. 71 (5), 801-805 (1996).
- Beppu, K., et al. Se-haplotype confers self-compatibility in Japanese plum (Prunus salicina Lindl). Journal of Horticultural Science and Biotechnology. 80 (6), 760-764 (2005).
- Guerra, M. E., Rodrigo, J., López-Corrales, M., Wünsch, A. S-RNase genotyping and incompatibility group assignment by PCR and pollination experiments in Japanese plum. Plant Breeding. 128 (3), 304-311 (2009).
- Guerra, M. E., Wunsch, A., López-Corrales, M., Rodrigo, J. Flower emasculation as the cause for lack of fruit set in Japanese plum crosses. Journal of the American Society for Horticultural Science. 135 (6), 556-562 (2010).
- Guerra, M. E., Wünsch, A., López-Corrales, M., Rodrigo, J. Lack of fruit set caused by ovule degeneration in Japanese plum. Journal of the American Society for Horticultural Science. 136 (6), 375-381 (2011).
- Fernández i Martí, A., Gradziel, T. M., Socias i Company, R. Methylation of the Sf locus in almond is associated with S-RNase loss of function. Plant Molecular Biology. 86, 681-689 (2014).
- Baggiolini, M. Les stades repérés des arbres fruitiers à noyau. Revue romande d’Agriculture et d’Arboriculture. 8, 3-4 (1952).
- Meier, U. Growth stages of mono-and dicotyledonous plants: BBCH Monograph. Federal Biological Research Centre for Agriculture and Forestry. , (2001).
- Fadón, E., Herrero, M., Rodrigo, J. Flower development in sweet cherry framed in the BBCH scale. Scientia Horticulturae. 192, 141-147 (2015).
- Fadon, E., Rodrigo, J. Combining histochemical staining and image analysis to quantify starch in the ovary primordia of sweet cherry during winter dormancy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (145), (2019).
- Hormaza, J. I., Pinney, K., Polito, V. S. Correlation in the tolerance to ozone between sporophytes and male gametophytes of several fruit and nut tree species (Rosaceae). Sexual Plant Reproduction. 9, 44-48 (1996).
- Burgos, L., et al. The self-compatibility trait of the main apricot cultivars and new selections from breeding programmes. Journal of Horticultural Science and Biotechnology. 72 (1), 147-154 (1997).
- Dicenta, F., Ortega, E., Cánovas, J. A., Egea, J. Self-pollination vs. cross-pollination in almond: pollen tube growth, fruit set and fruit characteristics. Plant Breeding. 121, 163-167 (2002).
- Alonso, J. M., Socias i Company, R. Differential pollen tube growth in inbred self-compatible almond genotypes. Euphytica. 144, 207-213 (2005).
- Hedhly, A., Hormaza, J. I., Herrero, M. The effect of temperature on pollen germination, pollen tube growth, and stigmatic receptivity in peach. Plant Biology. 7, 476-483 (2005).
- Hedhly, A., Hormaza, J. I., Herrero, M. Warm temperatures at bloom reduce fruit set in sweet cherry. Journal of Applied Botany. 81, 158-164 (2007).
- Milatović, D., Nikolić, D. Analysis of self-(in)compatibility in apricot cultivars using fluorescence microscopy. Journal of Horticultural Science and Biotechnology. 82, 170-174 (2007).
- Jia, H. J., He, F. J., Xiong, C. Z., Zhu, F. R., Okamoto, G. Influences of cross pollination on pollen tube growth and fruit set in Zuili plums (Prunus salicina). Journal of Integrative Plant Biology. 50, 203-209 (2008).
- Herrero, M., Salvador, J. La polinización del ciruelo Red Beaut. Información Técnica Econónomica Agraria. 41, 3-7 (1980).
- Ramming, D. W. Plum. Register of new fruit and nut varieties: Brooks and Olmo, List 37. HortScience. 30 (6), 1142-1144 (1995).
- Hartmann, W., Neümuller, M. Plum breeding. Breeding plantation tree crops: Temperate species. , 161-231 (2009).
- Guerra, M. E., López-Corrales, M., Wünsch, A. Improved S-genotyping and new incompatibility groups in Japanese plum. Euphytica. 186 (2), 445-452 (2012).
- Tao, R., et al. Molecular typing of S-alleles through identification, characterization and cDNA cloning for S-RNases in sweet cherry. Journal of the American Society for Horticultural Science. 124 (3), 224-233 (1999).
- Yamane, H., Tao, R., Sugiura, A., Hauck, N. R., Lezzoni, A. F. Identification and characterization of S-RNases in tetraploid sour cherry (Prunus cerasus). Journal of the American Society for Horticultural Science. 126, 661-667 (2001).
- López, M., Jose, F., Vargas, F. J., Battle, I. Self-(in)compatibility almond genotypes: a review. Euphytica. 150, 1-16 (2006).
- Bošković, R., Tobutt, K. R. Correlation of stylar ribonuclease zymograms with incompatibility alleles in sweet cherry. Euphytica. 90, 245-250 (1996).
- Beppu, K., Syogase, K., Yamane, H., Tao, R., Kataoka, I. Inheritance of self-compatibility conferred by the Se-haplotype of Japanese plum and development of Se-RNase gene-specific PCR primers. Journal of Horticultural Science and Biotechnology. 85, 215-218 (2010).
- Beppu, K., Kumai, M., Yamane, H., Tao, R., Kataoka, I. Molecular and genetic analyses of the S-haplotype of the self-compatible Japanese plum (Prunus salicina Lindl.) “Methley”. Journal of Horticultural Science and Biotechnology. 87 (5), 493-498 (2012).
- Beppu, K., Konishi, K., Kataoka, I. S-haplotypes and self-compatibility of the Japanese plum cultivar ‘Karari’. Acta Horticulturae. 929, 261-266 (2012).
- Sapir, G., Stern, R. A., Shafir, S., Goldway, M. S-RNase based S-genotyping of Japanese plum (Prunus salicina Lindl.) and its implication on the assortment of cultivar-couples in the orchard. Scientia Horticulturae. 118, 8-13 (2008).
- Karp, D. Luther Burbank’s plums. HortScience. 50 (2), 189-194 (2015).
